补肾调经汤对PCOS模型大鼠卵巢t-PA、PAI-1表达的影响.pdf

实用中医药杂志 2023年6月 第39卷6期（总第365期）JOURNAL OF PRACTICAL TRADITIONAL CHINESE MEDICINE 2023.Vol.39 No.61051 论著 基金项目江西省中医药管理局立项课题（2019B045）多囊卵巢综合征（polycysticovarysyndrome，PCOS）是育龄期女性常见的妇科内分泌紊乱疾病。流行病学调查显示，我国PCOS的患病率约为5.6%1。PCOS发病机制复杂，是一种涉及内分泌、代谢和遗传等多种因素的内分泌与代谢紊乱的疾病。临床表现以排卵障碍、高雄激素表现或高雄激素血症（Hyperandrogenism，HA）、卵巢多囊泡改变为主要特征，且具有多种疾病的发病风险，包括肥胖、胰岛素抵抗、心血管疾病、子宫内膜癌、甲状腺疾病以及心理疾患等1。PCOS近期治疗目标是调整月经周期、改善高雄激素体征、控制体质量及促进生育，远期目标是保护子宫内膜、降低心血管疾病和2型糖尿病风险。西医主要采用对症治疗，如降低雄激素、改善胰岛素抵抗、促进生育、改变生活方式、手术治疗以及辅助生殖技术。补肾调经汤以景岳全书中归肾丸为基础方加减而成。有研究发现，补肾调经汤使PCOS模型大鼠血清AMH含量及卵巢组织中AMHR的表达降低，并有效改善卵巢组织原始卵泡的发育及排卵状况。为深入研究补肾调经汤对PCOS的作用机制，笔者用补肾调经汤对PCOS模型大鼠进行干预，观察中药干预前后PCOS模型大鼠卵巢中t-PA、PA-1水平的表达，探索补肾调经汤对PCOS模型大鼠的作用及可能的机制，现报道如下。1材料与仪器 1.1主要药物选用70日龄左右（平均体质量270.562.13g）的SPF级SD雌性大鼠40只，购于南昌大学医学部实验动物中心，动物许可证号SYXK（赣）2010-0002。1.2主要药物炔雌醇环丙孕酮片（达英-35，拜耳医药保健有限公司广州分公司，国药准字J20100003）。补肾调经汤药用炒菟丝子10g，当归10g，党参15g，黄芪15g，山茱萸10g，生地10g，怀牛膝10g，土鳖虫10g，补肾调经汤对PCOS模型 大鼠卵巢t-PA、PAI-1表达的影响王巧，祝佩，陈晓勇（江西省妇幼保健院/江西省中西医结合女性生殖重点研究室/江西省中西医结合妇科病诊疗中心中医科，江西 南昌 330006）中图分类号R271.9 文献标识码B 文章编号1004-2814（2023）06-1051-03摘要目的：观察补肾调经汤对PCOS模型大鼠卵巢t-PA、PAI-1表达的影响。方法：用来曲唑造模法建立雌性大鼠PCOS模型，设置正常对照组、模型组、西药组、中药组。通过阴道涂片观察大鼠动情周期，ELISA法检测大鼠血清T水平，电镜观察卵巢形态，Western blot检测测定大鼠卵巢t-PA、PAI-1蛋白的表达。结果：与正常对照组比较，模型组大鼠血清T水平升高，窦卵泡数增多，颗粒细胞层数减少，卵巢组织t-PA表达降低、PAI-1表达升高（P0.01）；与模型组比较，中药组和西药组血清T水平下降，窦卵泡数减少，颗粒细胞层数增多，卵巢组织 t-PA 表达升高、PAI-1 表达降低（P0.01）。结论：PCOS的发病可能与卵巢t-PA、PAI-1的异常表达有关，补肾调经汤可能能够通过调节t-PA、PAI-1的表达恢复卵巢正常生殖功能，维持生殖内分泌稳态，达到治疗PCOS的作用。关键词多囊卵巢综合征；补肾调经汤；t-PA、PAI-1；影响AbstractObjective：ToobservetheeffectofBushenTiaojingDecoctionontheexpressionoft-PAandPAI-1inovaryofPCOSmodelrats.Methods:ThePCOSmodeloffemaleratswasestablishedbyusingthemethodoftrazolmodeling,andthenormalcontrolgroup,modelgroup,westernmedicinegroupandChinesemedicinegroupweresetup.Theestrouscycleofratswasobservedbyvaginalsmear.TheserumTlevelwasdetectedbyELISA.Theovarianmorphologywasobservedbyelectronmicroscope,andtheexpressionoft-PAandPAI-1proteininratovarywasdetectedbyWesternblot.Results:Comparedwiththenormalcontrolgroup,theserumTlevelofratsinthemodelgroupincreased,thenumberofsinusfolliclesincreased,thenumberofgranulosacellsdecreased,andthet-PAexpressioninovariantissuedecreasedwhilethePAI-1expressionincreased(P0.01).Comparedwiththemodelgroup,theserumTleveldecreased,thenumberofsinusfolliclesdecreased,thenumberofgranulosacellsincreased,andthet-PAexpressioninovariantissueincreasedwhilethePAI-1expressiondecreasedintheChinesemedicinegroupandtheWesternmedicinegroup(P0.01).Conclusion:ThepathogenesisofPCOSmayberelatedtotheabnormalexpressionoft-PAandPAI-1inovary.BushenTiaojingDecoctionmayrestorethenormalreproductivefunctionofovarybyregulatingtheexpressionoft-PAandPAI-1,maintainthereproductiveendocrinehomeostasis,andachievetheeffectoftreatingPCOS.KeywordsPolycysticovarysyndrome；BushenTiaojingDecoction；t-PA,PAI-1；Effect实用中医药杂志 2023年6月 第39卷6期（总第365期）JOURNAL OF PRACTICAL TRADITIONAL CHINESE MEDICINE 2023.Vol.39 No.61052皂刺片10g，山慈姑10g，仙茅3g。中药材购于江西省妇幼保健院，将所得药液用水浴锅浓缩至生药含量为1.13g/mL的中药药液，装于无菌小瓶内，冰箱4保存。1.3试剂与仪器RatTELISA试剂盒，Cusabio公司；Anti-PLATAntibody，产品批号A02965-1，武汉博士德生物工程有限公司；Anti-SERPINE1Antibody，产品批号：A00637-2，武汉博士德生物工程有限公司；普通光学倒置显微镜（TS100-F型），日本Nikon公司。2方法2.1PCOS大鼠模型制备采用来曲唑造模法建立雌性大鼠PCOS模型。2.2动物分组与给药方法随机将大鼠分为正常对照组、模型组、西药组和中药组各10只。各组大鼠都以相同标准的饲料饲养，除空白组外其余组大鼠均按上述方法造模。按照大鼠与人之间的用药剂量公式进行换算，得出中药组每只大鼠给药剂0.012g/（gd）；西药组每只大鼠给药剂量0.0002mg/（gd）。2.3观察指标与检测方法造模21d，剖开大鼠胸腔穿刺心脏采血，ELISA法检测大鼠血清T水平，完整留取卵巢组织，福尔马林固定、常规石蜡包埋切片、苏木精染色、酒精梯度脱水、中封片胶封片，电镜观察卵巢内卵泡形态，Westernblot测定t-PA、PAI-1表达。2.4统计学方法用SPSS17.0统计软件进行统计，计量资料以（xs）表示；多组间均数的比较，方差齐时采用单因素方差分析，方差不齐时采用KruskalWallisH法。P0.05为差异有统计学意义。3结果3.1大鼠一般情况造模后的大鼠均出现体态肥胖，行动较为迟缓，倦怠嗜睡，活动少，毛色灰暗无光泽，且偶有脱毛等。而正常大鼠精神、摄食、活动等一般情况均较好，对外界刺激反应敏捷。空白组大鼠阴道涂片结果显示有规则的动情周期变化，周期为45d。模型组大鼠阴道涂片结果显示动情周期不规律，以动情周期为主，阴道涂片显示分泌物减少，偶尔可见少量无核角化细胞和有核上皮细胞，较多的白细胞持续存在。西药组和中药组给药处理后，紊乱的动情周期有所改善，表现为动情周期、动情间期逐步恢复，趋于正常。3.2大鼠血清激素水平比较模型组大鼠血清T水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P0.05）；与模型组比较，治疗大鼠血清T水平均有下降趋势，但差异无统计学意义（P0.05）；中药组大鼠血清T水平低于西药组，差异无统计学意义（P0.05）。见表1。表1各组大鼠血清T水平比较（xs）组别鼠数T（ng/L）正常对照组 模型组西药组中药组101010102.5730.3133.0170.2362.8700.1122.8940.1743.3各组大鼠卵巢组织卵泡形态的比较窦卵泡数不同组别组间比较，正常对照组与模型组比较差异有统计学意义（P0.05）；模型组与治疗组比较差异有统计学意义（P0.05）；中药组、西药组组间比较差异无统计学意义（P0.05）。颗粒细胞层数不同组别组间比较，正常对照组与模型组比较差异有统计学意义（P0.05）；模型组与治疗组比较差异有统计学意义（P0.05）；中药组、西药组组间比较差异无统计学意义（P0.05）。见表2。表2各组大鼠卵巢组织窦卵泡数及颗粒细胞层数的比较（xs）组别鼠数窦卵泡数（个）颗粒细胞层数（层）正常对照组模型组西药组中药组101010108.602.5715.373.239.893.789.883.638.300.671.750.717.890.788.130.833.4各组大鼠卵巢组织t-PA、PAI-1表达比较与正常对照组比较，模型组大鼠卵巢组织t-PA表达降低，差异有统计学意义（P0.01）；与模型组比较，治疗组大鼠卵巢组织t-PA表达增高，差异有统计学意义（P0.01），中药组与西药组比较差异无统计学意义（P0.05）；与正常组比较，治疗组大鼠卵巢组织t-PA表达稍低，差异无统计学意义（P0.05）。与正常对照组比较，模型组大鼠卵巢组织PAI-1表达升高，差异有统计学意义（P0.01），中药组与西药组比较差异无统计学意义（P0.05）；与模型组比较，治疗组大鼠卵巢组织PAI-1表达降低，差异有统计学意义（P0.01），中药组与西药组比较差异无统计学意义（P0.05）；与正常组比较，治疗组大鼠卵巢组织PAI-1表达增加，差异有统计学意义（P0.01），中药组与西药组比较差异无统计学意义（P0.05）。见表3。T-PA62kdgapdh36kd正常对照组模型组中药组西药组PAI-144kdgapdh36kD正常对照组模型组中药组西药组表3各组PCOS模型大鼠卵巢t-PA、PAI-1表达比较（xs）组别鼠数t-PAPAI-1正常对照组模型组西药组中药组1010101013449.803257.625321.601111.4010349.602496.3210395.602858.258429.00707.5425209.60779.6216473.581029.0416196.001081.254讨论多囊卵巢综合征（polycysticovarysyndrome，PCOS）是育龄妇