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308发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4补救胞浆内单精子注射受精失败的原因分析任晶辉1 土增荣2高瑞璠2 （1.山西医科大学第一临床医学院，山西太原 030000；2.山西医科大学第一医院生殖中心，山西太原030000）综述 全 世 界 1.86 亿 人 患 有 不 孕 症，育 龄 夫 妇占 8%12%，且发病率逐年增加1。体外受精（in vitro fertilization，IVF）与胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）是 目 前 最常用且有效的辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART），为不孕夫妇带来希望。遗憾的是，即使 IVF 技术日益完善，完全受精失败的风险仍不可避免，其发生率为 5%20%2-3。早期补救胞浆内单精子注射（rescue intracytoplasmic sperm injection，r-ICSI）的出现，可以在不取消 ART 周期的情况下，直接对IVF未受精的卵母细胞进行补救，避免了周期的取消以及完全受精失败的发生，使经济成本下降了 25%，也缓解了患者的精神压力4-5。ICSI 与体外自然受精过程有很大不同，需要机械移除颗粒细胞，绕过透明带、卵膜和细胞器，将单个精子显微注射入卵母细胞，减少完全受精失败的发生6。换言之，ICSI 是 IVF 中绕过精子/卵母细胞融合缺陷的最有效的治疗方法，然而 ICSI 的 完全受精失败的发生率在周期内仍有 1%5%6-8。由于其具有侵入性需要更高的技术支持以及经济成本，ICSI 主要适用于严重男性因素不孕以及 IVF受精失败的患者9-10。受精是胚胎形成的起点，受精率是反映 ART 妊娠结局最重要的指标。对于 IVF 失败的患者，ICSI是从下一周期重新取卵进行操作；而 r-ICSI 是在当前的 IVF 周期，对患者受精失败的卵母细胞进行ICSI。r-ICSI 与 ICSI 的受精时间略有差异，但受精原理相同。因此，可将 ICSI 的受精失败原因作为参考，更全面分析r-ICSI受精失败的原因。导致r-ICSI/ICSI 受精失败的原因很多，多数学者认为，r-ICSI/ICSI 受精失败很大程度上归因于卵母细胞激活失败以及卵母细胞老化11-12。本文就 r-ICSI 受精失败的原因进行分析，以期更深刻地了解 r-ICSI，对临床提供参考意义。1卵母细胞老化卵母细胞经历的是一种时间依赖的质量恶化过程。在体内，卵母细胞如果在 48 h 内没有受精，排卵后输卵管中的卵母细胞就会逐渐老化并失去活性13-14。在体外，卵母细胞如果在受精前就开始老化，则会影响受精率和胚胎的发育，进而影响妊娠结局15-16。然而，据报道，80%的受精卵在 4 h 时释放第二极体，90%的受精卵在 6 h 时释放第二极体，而有 10%的卵母细胞可能会发生第二极体释放延迟13。过早进行 r-ICSI，会导致这些第二极体释放延迟的卵母细胞 3 个原核合子的形成17。因此，平衡卵母细胞衰老和多精子受精的时间风险对于 r-ICSI 是非常重要的。掌握卵母细胞去除积云细胞和进行 r-ICSI 的时间窗，可以提高受精率和妊娠率。卵母细胞取出后，将周围的卵丘细胞用机械和DOI：10.3969/j.issn.2095-5340.2023.04.011通信作者：土增荣（Email：）发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4309酶的方法去除，以确定卵母细胞中存在第二极体，识别未受精的卵母细胞并进行 r-ICSI18。卵丘细胞可以释放雌二醇和孕酮，有助于卵母细胞成熟，若去除过晚会加速卵母细胞的衰老；若去除过早，则降低了培养基中雌二醇和孕酮的浓度，也降低了卵丘细胞和精子产生的氧化代谢物水平，这可能对胚胎发育潜力有不利影响19-20。研究表明，早期r-ICSI 在受精 4 h 后去除卵丘细胞，对受精、妊娠和新生儿结局没有明显影响，较为安全20-21。卵丘细胞去除后，对观察到的未排出第二极体（受精失败）的卵母细胞进行 r-ICSI。Nagy 等18首先提出晚期 r-ICSI，对受精失败的卵母细胞在 1 d后进行补救，然而受精率（38%）却不尽理想22-24。之后研究者认为，晚期 r-ICSI 结果不佳是由卵母细胞老化造成的，并提出早期 r-ICSI，即在初始受精 6 h 后对未受精卵母细胞进行 r-ICSI，受精率（70%）显著高于晚期 r-ICSI25。早期 r-ICSI 的最佳时间一般在取卵后 67 h 进行。董娟等26分析了不同 r-ICSI时间组，发现受精后 47 h 行 r-ICSI 可获得理想的临床结局，其中，受精后 56 h 行 r-ICSI 的临床结局最好，7 h行r-ICSI的临床结局较差。Shiraiwa等17认为在共孵育 6 h 后进行 r-ICSI 效果最好，在此时所有未出现受精迹象的卵母细胞均应进行 r-ICSI。综上所述，准确把握卵母细胞脱颗粒时间和进行 ICSI 的时间，可以提高受精率，获得良好妊娠结局，这是提高 r-ICSI 成功率的关键。近期有研究发现，晚期 r-ICSI 结合冷冻胚胎移植可能克服了晚期 r-ICSI 后新鲜移植的大部分技术和生物学问题，从而改善结局27-28。因此，即使错过最佳的r-ICSI 时间，患者仍有希望通过冷冻移植获得较高的妊娠结局。2卵母细胞激活障碍2.1内质网Ca2+释放不足导致的卵母细胞激活障碍受精成功并不只是精子和卵母细胞的单纯融合，还需要激活卵母细胞。精子诱导的Ca2+在卵母细胞内振荡，并伴随许多有序的生物学事件，从而促进卵母细胞的激活，包括阻止多精受精、促进原核形成，从而使其进入受精卵的有丝分裂期。钙是调节细胞生物学行为的关键因素。卵母细胞胞浆中Ca2+水平的持续增加是r-ICSI成功的关键，是正常受精和胚胎发育的重要过程7。卵母细胞的激活过程实际上是从第2次减数分裂恢复到有丝分裂开始的过渡过程。在正常的受精过程中，激活过程是在精子头与卵母细胞膜融合后触发，增加卵母细胞血浆中肌醇1,4,5-三磷酸（inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3）水平。然后，IP3与内质网上的受体结合，导致内质网释放Ca2+。最后，细胞质中的Ca2+被重新吸收入内质网。经过这一重复过程后，卵母细胞胞浆中Ca2+水平暂时升高，引起Ca2+振荡，促进蛋白激酶C和其他Ca2+依赖蛋白激酶的激活，引起下游蛋白磷酸化，提升细胞活性。因此，在r-ICSI周期中，内质网Ca2+释放不足会导致卵母细胞激活功能障碍，继而受精失败。目前，可以通过物理和化学方法，包括电刺激、机械刺激、化学激活钙离子载体（A23187）或离子霉素、氯化锶活化、磷脂酶C（phospholipase C zeta，PLC/PLCZ1）活化等刺激激活哺乳动物卵母细胞，使存在激活障碍的卵母细胞被重新激活11。从分子的角度来看，内质网Ca2+的释放在卵母细胞激活中发挥着不可或缺的作用。而Ca2+释放不足更深层的原因为基因突变导致的卵母细胞激活障碍，逐渐成为研究者们的研究热点。2.2基因突变导致的卵母细胞激活障碍顶体是一种独特的膜质细胞器，含有多种水解酶；它在卵子透明带的穿透和精子与卵子的质膜相互作用中起着重要作用。顶体的完整性对受精至关重要。遗传因素会影响顶体的完整性，在卵母细胞激活缺陷中起着重要作用。精子特异性基因PLC/PLCZ1、肌动蛋白样蛋白9（actin like 9 protein，ACTL9）和 肌动蛋白样蛋白7A（actin like protein 7A，ACTL7A）的有害突变，通过影响各种酶的活性或者顶体的完整性阻碍了卵母细胞的激活，被认为是ICSI后完全受精失败的重要原因之一。2.2.1PLC突变PLC/PLCZ1是一种重要的310发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4精源性卵母细胞活化因子，也是触发卵母细胞激活的关键。PLC位于精子核周膜面朝顶体和赤道区，可以水解卵母细胞中的磷脂酰肌醇（4,5）-二磷酸（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2），导致细胞内钙释放和卵母细胞激活。PLC 主要由2个功能不同的区域组成，在蛋白质的三维结构中可以区分为催化区域（X和Y结构域，负责酶活性，即卵母细胞胞浆内囊泡PIP2的水解）和调控区域（具有高钙敏感性的EF-hands结构域和与C2-结构域）29-30。Heytens等31在PLC中发现位于Y催化结构域的突变（p.H398P），建立了PLC突变与人类不孕症之间的第1个联系；Kashir等30在PLC中发现位于X催化结构域的突变（p.H233L），确定了PLC在卵母细胞激活中的生理重要性。Escoffier等32在2个不育兄弟的纯合子中发现了一个位于C2域的突变（p.I489F），发现PLC突变会导致异常的钙振荡和完全受精失败。Ferrer-Vaquer等33在受精失败的患者中发现另一种错义突变（p.S500L），但未进行功能检测。2019年，Torra等34对37例由卵母细胞激活失败或其他原因引起的受精失败的患者进行了大规模队列的研究，发现几乎60%的卵母细胞激活患者出现PLCZ1突变。通过对PLC/PLCZ1基因测序，发现6个突变：5个单核苷酸错义突变，位于EF-hand结构域的突变p.I120M，位于X催化域的突变p.R197H、p.L224P、p.H233L，位于C2区域的突变p.S500 L；以及1个由两个核苷酸的缺失引起的移码，这种移码在X-Y连接上产生一个过早的停止密码子（p.V326K fs 25），导致Y和C2域的丢失，并严重破坏PLC/PLCZ1的催化功能。Torra-massana等34认为，PLC/PLCZ1的催化域的点突变可能会以很高的概率影响酶的活性；EF-hand和C2域的点突变可能会影响其调控能力，仍需要进一步研究结合特异性、钙依赖性和调控能力等点突变的生理意义。2020年，Dai等35在10例ICSI中表现出完全受精失败和受精不良（受精率T;1084GA,p.(Arg155Ter);(Gly362Arg)。这是首次在人类中发现了引起完全受精失败的ACTL7A新变异。通过透射电镜发现，相比于正常精子，突变的精子顶体与核膜分离，出现折叠和皱缩现象，精子核周膜厚度增加且不规则。通过免疫荧光染色法检测到突变体精子中的ACTL7A表达几乎缺失，PLC的信号显著降低。结果表明，致病性ACTL7A突变导致精子顶体和精子核周膜的超微结构缺陷，ACTL7A和PLC的表达减少，这可能是ICSI后完全受精失败的原因。Dai等39在1例严重畸形精子症的患者中发现ACTL7A的变体c.1204GA,p.Gly402Ser，并生成了相应的基因突变的小鼠模型，发现突变精子通过影响顶体组装和肌动蛋白的形成，未能激活卵母细胞，导致完全受精失败，揭示了ACTL7A致病变异的潜在机制。见表1。3卵母细胞特异性基因突变导致的受精失败3.1WEE2基因突变WEE2是促成熟因子抑制激酶的关键，参与维持减数分裂阻滞。2018年，Sang等40首次在人类中发现卵母细胞特异性基因WEE2的突变。这些患者的卵母细胞形态正常，注射精子后，可以挤出第二极体，但不能形成合子，导致受精失败。最近，Tian等41和OH 等42发现WEE2存在一种新的复合杂合子突变，发现几乎所有WEE2突变患者在M卵母细胞第1天原核形成完全障碍，证实了WEE2基因是促进卵母细胞激活和原核形成的关键因素。体外和体内证据表明，WEE2蛋白位于