渤海湾7种虾虎鱼科鱼类COI基因序列特征及分子分类研究.pdf

天津农业科学TianjinAgricultural Sciences畜牧兽医与水产养殖渤海湾7 种虾虎鱼科鱼类COI基因序列特征及分子分类研究2023,29(9):32-37房恩军，郭彪，郑德斌，张雪，王硕，王宇（天津市水产研究所天津市海洋牧场技术工程中心，天津30 0 2 2 1）摘要：为获得渤海湾天津海域常见虾虎鱼线粒体条形码序列及系统分类信息，采集渤海湾7 种虾虎鱼样本，通过形态初步鉴定物种，并提取DNA进行线粒体COI基因部分序列扩增测序，用系统进化分析及分子鉴定软件MEGA对渤海湾常见12 种虾虎鱼COI基因部分片断进行序列特征分析及分子分类分析。扩增得到7 种虾虎鱼COI基因片断，分析得到其平均GC含量低于AT含量,碱基在密码子位置分布中具有偏向性,且GC含量最高为第2 位碱基,与多种鱼类COI基因碱基特点相似。基因密码子碱基变异率为19.4%，转换颠换比为1.3。遗传距离分析及系统进化树分析理清了渤海湾天津海域12 种主要虾虎鱼的系统分类及进化关系。遗传距离显示，矛尾刺虾虎鱼(Amblychaeturichthys hexanema)和斑尾复虾虎鱼(Synechogobius ommaturus)为同种鱼。虾虎鱼COI编码基因密码子高变异率可能与其良好的环境适应性有关。关键词：渤海湾虾虎鱼；线粒体细胞色素c氧化酶亚基(COI)；系统进化中图分类号：Q917.4Sequence and Molecular Classification of COI Gene of Seven Species of Goby from the Bohai BayFANG Enjun,GUO Biao,ZHENG Debin,ZHANG Xue,WANG Shuo,WANG Yu(Tianjin Fisheries Research Institute,Center for Marine Ranching Engineering Science Research of Tianjin,Tianjin 300221,China)Abstract:In order to clarify the mitochondrial barcode sequence and taxonomic information of common goby fish in Tianjin area ofBohai Bay,seven species of goby fish were collected from Bohai Bay,identified by morphology,and DNA was extracted for amplifica-tion and sequencing of mitochondrial COI gene fragments.Phylogenetic analysis and molecular identification software MEGA wereused to analyze the sequence characteristics and molecular classification of COl gene fragments of 12 common goby species in BohaiBay.Seven COI gene fragments of Goby were amplified and sequenced,the average GC content was lower than AT content,the basehad a bias in the codon position distribution,and the highest GC content was the second base,which was similar to the COI gene baseof many fishes.The codon base variation rate was 19.4%,and the ratio of transitions to transversions was 1.3.Phylogenetic distanceanalysis and phylogenetic tree analysis clarified the phylotaxonomic and evolutionary relationships of 12 major goby species in Tianjinarea of Bohai Bay.Genetic distance indicated that Amblychaeturichthys hexanema and Synechogobius ommaturus were the samespecies.The high codon variation rate of codon encoding gene in Goby may be related to its good environmental adaptability.Key words:Goby of the Bohai Bay;cytochrome oxidase subunit I(CO)gene;phylogenetic analysis文献标识码：ADOI编码：10.39 6 9/j.issn.1006-6500.2023.09.006渤海湾是一个浅水淤泥质半封闭海湾，历史上饵料丰富,基础条件优越,是渤海鱼类的产卵场。近年来，由于围填海工程、水域污染和过度捕捞等因素的影响，渔业资源的生存环境恶化,影响了其生态系统结构和功能，渔业资源衰退，小型化、低值化问题突出，种类和数量也在减少。年度调查表明，天津海域产卵场逐渐退化，与历史调查数据相比，渤海湾鱼类浮游生物的丰度和多样性显著减少，经济鱼类渔获和产卵量也逐渐减少-2。而虾虎鱼由于环境适应力强，繁殖力强和生命周期短等特点3,其资源量稳定增加，已逐渐代替其他经济鱼类，成为渤海湾天津海域春季休渔期前鱼类群落及仔稚鱼的优势种,在海洋食物网中发挥着重要的作用。但是虾虎鱼种类繁多,且有关仔稚鱼的形态相近，相关资料较少，鉴定难度大,准确性难以保证,虾虎鱼仔稚鱼鉴定也是世界难点和是鱼类早期资源研究的重要内容。20世纪9 0 年代以来，国内外科学家发现线粒体一些短的基因（如细胞色素氧化酶第一亚基收稿日期：2 0 2 3-0 4-17基金项目：国家重点研发计划（2 0 19 YFE01223000；2 0 19 Y FD 0 9 0 2 10 2）；天津市海水养殖现代农业产业技术体系创新团队项目(ITTMRS2021005)作者简介：房恩军（19 6 8 一），男，天津人，高级工程师，主要从事渔业资源修复及评估技术研究。通讯作者简介：王宇（19 8 6 一），女，湖北鄂州人，工程师，硕士，主要从事渔业资源修复及评估技术研究。第9 期房恩军等：渤海湾7 种虾虎鱼科鱼类COI基因序列特征及分子分类研究33(COI)基因、12 s rRNA、细胞色素B(CtyB)等)进化速率快且相对保守，其中COI基因5端6 50 bp片断可有效区分种间物种,可作为物种分类的DNA条形码(DNABarcoding）,随后与之配套的数据库也日趋完善，广泛应用于生命科学、法医学、食品质量控制等领域，也为鱼类浮游生物种类的分子鉴定奠定了良好的基础4-9 。虾虎鱼亚目（Gobioidei)有两千余种虾虎鱼，腹鳍合成一个吸盘,是鲈形目中最大的一个类群。虾虎鱼多为小型底栖鱼类，主要以小型底栖甲壳动物为食，在渤海湾生态系统中能量流动和物质循环中有重要作用，是底层食物链的关键物种。根据渤海鱼类生物学记载，渤海湾天津海域历史上能采集到的虾虎鱼有12 种左右,其中拉氏狼牙虾虎鱼（Odontamblyopus rubicundus）、斑尾腹虾虎鱼（Sy n e c h o g o b i u s o mma t u r u s）具有一定的经济价值。除了小头栉孔虾虎鱼。常见的虾虎鱼的线粒体(COI)基因片断均能在数据库中获取。但是虾虎鱼形态多变、各地名称不统一等原因，需要通过扩增进一步明确序列信息。本研究选择渤海湾常见7 种虾虎鱼类作为研究对象,通过获取线粒体(COI)基因序列分析比较其序列变异情况，进一步进行系统发育及遗传分析,从而为鱼类DNA条形码库及鱼类浮游生物的鉴定积累基础数据，为渤海海洋食物网的研究和稳定，为渤海湾虾虎鱼资源保护和合理开发利用提供科学依据。1材料与方法1.1样品采集样品来源于2 0 18 年春季和夏季渤海湾水域地笼或拖网采样，参照渤海鱼类生物学共鉴定出矛尾刺虾虎鱼（Amblychaeturichthys hexanema)、裸颈镐虾虎鱼（TridentigerNudicervicus）、矛尾虾虎鱼(Chaeturichthysstigmatias)红狼牙虾虎鱼(Odontamblyopusrubicundus）弹涂鱼（Periophthalmus modestus）钟道虾虎鱼（Triaenopogonbarbatus）、小头栉孔虾虎鱼(Ctenotrypauchen microcephalus)7种7 个虾虎鱼。样本用9 5%的乙醇混合保存后取鱼鳍。1.2DNA 提取采用酚-氯仿法提取DNA,取鱼尾鳍0.5g放人1.5mL的离心管中,将鱼鳍剪碎后加入裂解液和蛋白酶涡旋混匀，离心后于56 消化3h，酚-氯仿抽提后2 倍无水乙醇沉淀，7 5%乙醇洗涤吹干后以ddH20溶解，4冰箱保存。1.3引物设计及PCR扩增在上海生工合成Ward2文献中鱼类COI通用引物:FishF1(5-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3),FishR1(5-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3)。组建一个2 5LPCR反应体系：模板DNA2.0 ddH,06.5 lPremix Taq12.5 L引物各2.0 LPCR扩增的程序为：952 min95 变性 40 s92退火1 min72 延伸 1 min72 延伸5 minPCR扩增产物通过琼脂糖凝胶(1.5%)电泳1520min，凝胶电泳成像仪检测后送至上海欧易生物技术有限公司进行双向测序，测序引物为扩增引物。1.4数据分析从BOLD数据库中获取鲈形目的石首鱼科黄姑鱼（Ni b e a a l b i f l o r a）、马科的四指马（Eleutheronematetradactylum）鲽形目的舌鳎科短吻红舌鳎(Cynoglossusjoyneri）、半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）共4种鱼类的同源序列作为外群，同时从NCBI和BOLD数据库下载天津可能存在的虾虎鱼序列，结合测序序列进行系统进化分析(表1）。对所获得的序列利用MEGA进行多序列比对，人工核查后，用“Statistics”程序计算序列碱基组成、遗传颠换值、变异位点、密码子偏向性等。不同个体间的遗传距离用 Distance程序下的Kimura双参数模型计算。用Modeltest检测出最适合的核苷酸序列分析模型后采用邻位连接法(Neighbor-Joining,NJ)构建进化树Bootstrap置信值重复抽样10 0 0 次。2结果与分析2.1渤海湾7 种虾虎鱼的 COI基因序列特征将扩增测序得到的COI序列进行blast比对,相似度大于9 8%的即为同一种，比对结果支持形态鉴定结果。多序列比对得到6 52 bp共有序列，证实COI可以用作物种鉴定条形码8。碱基特征分析得到7 种虾虎鱼的COI基因部35个循环34物种名称四指马黄姑鱼短吻红舌鳎半滑舌鳎矛尾刺虾虎鱼矛尾虾虎鱼钝尖尾虾虎鱼晴尾蝌蚪虾虎鱼红狼牙虾虎鱼弹涂鱼斑尾复虾虎鱼钟道虾虎鱼裸颈虾虎鱼暗虾虎鱼纹虾虎鱼小头栉孔虾虎鱼分序列符合硬骨鱼类G+C含量（44.6%）小于A+T含量(55.4%)的特点4。密码子的碱基使用频率存在一定的偏向性，平均