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第 56 卷 第 10 期 2023 年 10 月 天津大学学报(自然科学与工程技术版)Journal of Tianjin University(Science and Technology)Vol.56 No.10Oct.2023 收稿日期：2022-06-08；修回日期：2022-07-26.作者简介：齐 崴（1973 ），女，博士，教授，.通信作者：王梦凡，.基金项目：国家自然科学基金资助项目(22178260)；拱北海关技术中心合作项目(2020GKF-0281).Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.22178260)，the Project of Technical Center of Gongbei Customs District of China(No.2020GKF-0281).DOI:10.11784/tdxbz202206008 表面增强拉曼光谱法对食源性致病菌的鉴别 齐 崴1,2，杨 钰2,3，王梦凡2,3(1.天津大学化工学院，天津 300350；2.天津化学化工协同创新中心，天津 300072；3.天津大学生命科学学院，天津 300072)摘 要：表面增强拉曼光谱(SERS)以其简单、快速、高灵敏度等优点在食源性致病菌检测应用领域备受关注本文基于 SERS 的指纹光谱优势，结合数学统计方法，实现了对食品中 3 种常见致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌)的鉴别分析研究中考察了 SERS 基底与细菌的不同结合方式，即带负电银纳米粒子直接与细菌混合吸附(AgNPs-细菌)、带正电银纳米粒子直接与细菌混合吸附(AgNPs+-细菌)、在细菌表面原位生长银纳米粒子(细菌AgNPs)，以及分散溶剂对 SERS 光谱结果的影响随后，基于获得的 3 种细菌的 SERS 指纹光谱，比较了多种数学统计方法的分类效果结果表明，通过层次聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘判别分析法，均能对 3 种食源性致病菌进行区分，为利用 SERS 技术鉴别食源性致病菌提供了技术借鉴 关键词：表面增强拉曼光谱；食源性致病菌；统计分析；指纹光谱 中图分类号：Q5-33 文献标志码：A 文章编号：0493-2137(2023)10-1003-10 Identification of Foodborne Pathogen Using Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Qi Wei1,2，Yang Yu2,3，Wang Mengfan2,3(1.School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300350，China；2.Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering(Tianjin)，Tianjin 300072，China；3.School of Life Sciences，Tianjin University，Tianjin 300072，China)Abstract：Surface-enhanced Raman spectroscopy(SERS)has attracted increasing interest due to its simple opera-tion，rapid response，and high sensitivity.In this study，using the SERS spectra of bacteria that provide rich charac-teristic information，three pathogenic bacteria(Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Enterococcus fae-calis)were detected and identified through mathematical statistical methods.The fingerprint spectra of the three bacte-ria were obtained by optimizing the combination of SERS substrates，e.g.，electrostatically binding to negatively charged AgNPs(AgNPs-bacteria)，electrostatically binding to positively charged AgNPs(AgNPs+-bacteria)and in situ growth of AgNPs on bacteria(bacteriaAgNPs)，as well as dispersion solvents.Based on the results of Raman fingerprint spectra of the three bacteria，a variety of mathematical and statistical methods were explored.The results showed that the hierarchical clustering analysis，principal component analysis，and orthogonal partial least squares discriminant analysis are capable of classifying the fingerprint spectra of the three foodborne pathogens.This study provided a potential method for identifying foodborne pathogens using the SERS technology.Keywords：surface-enhanced Raman spectroscopy(SERS)；foodborne pathogen；statistical analysis；fingerprint spectrum 1004 天津大学学报(自然科学与工程技术版)第 56 卷 第 10 期 食源性致病菌感染是全球重大公共安全问题，严重威胁人类健康1-2 据美国食品药品监督管理局报道，每年大约有 4800 万相关病例因受污染的食物而患病 大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)是典型的食源性致病菌，广泛存在于世界各地，可能会导致轻度至重度胃肠疾病3-5，因此中国国家市场监管局、美国食品药品监督管理局和欧共体食品科学委员会均制定了严格的限量标准 粪肠球菌(Enterococcus fae-calis，E.faecalis)是一种条件致病菌，正常情况下不会引起感染，但是如果给予健康个体生理干扰比如药物治疗等，粪肠球菌会急剧繁殖，引起不同类型的感染 据报道，目前肠球菌感染约占美国医院感染的12%，其中 80%由粪肠球菌引起6 因此，建立针对致病菌的快速检测方法对确定食品中微生物污染种类和来源具有重要意义7 传统的致病菌检测方法主要包括培养分析和代谢试验8-9，其检测过程可能需要几天到一周的时间，很难满足紧急事件快速检测的需要 目前病原菌的检测方法多采用核酸聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫法(ELISA)，具有特异性高、灵敏度高、观察方便等优点8-10，但仍有步骤复杂、样品预处理耗时、对检测人员操作熟练程度的要求较高等缺陷11 自从表面增强拉曼散射现象在粗糙的银金属表面上被首次观察到以来，表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)在化学、材料科学、分析科学、生物医学研究12-15等领域受到越来越多的关注 与传统的生物分析方法相比，SERS 超高的表面灵敏度和能够反映生物系统内的分子本征结构信息(即“指纹光谱”)的优势使其在生物分析领域显示出特别的优势16 除此之外，SERS 指纹检测无需使用例如荧光或化学发光染料等进行标记，样品的制备更加简单，能够满足快速检测的需要17-19 细菌细胞的拉曼信号主要来源于表面化学成分以及代谢物，因此不同细菌往往因为细胞壁成分类似而导致其 SERS 指纹光谱相似性很高，仅通过对单波段强度的简单分析不可能完成对不同细菌的区分，需要运用数学统计分析方法对 SERS 光谱数据进行处理 Boardman 等20通过聚类分析区分了 17 种在临床上与菌血症相关的菌株的 SERS 光谱；Witkowska等21通过主成分分析(PCA)区分了两种常见的牙周炎关键病原体、牙龈假单胞菌和放线菌菌株；Prakash等22通过主成分分析鉴别大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和枯草芽孢杆菌 3 种细菌 Bruer 等23通过偏最小二乘法区分了在苯乙烯-二乙烯基苯聚合物的大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的拉曼光谱 在本研究中，SERS 技术被用于鉴别食品中的致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌 金黄色葡萄球菌与粪肠球菌同属于革兰氏阳性菌，而大肠杆菌是典型的革兰氏阴性菌 与小分子分析物相比，细菌等微生物的尺寸达到微米级别，SERS 基底和细菌之间的结合不易控制 此外，光激发下细菌样品的稳定性、细菌的不同生长阶段以及样品的制备环境等，都可能导致细菌 SERS 指纹光谱信息的波动 因此，针对细菌拉曼光谱检测中信号重现性和稳定性差、强度低的问题，笔者利用银纳米粒子作为SERS 基底，考察了 SERS 基底与细菌的不同结合方式对细菌指纹光谱的增强效果，确定了一种稳定性好、光谱强度高、指纹特征丰富的细菌 SERS 基底结合方法 基于获得的高质量指纹光谱，分别利用层次聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别法(OPLS-DA)对 3 种细菌的 SERS 光谱数据进行鉴别，HCA 能够将不同类别的样本进行分类，PCA 能够将光谱数据降维处理并找出关键谱带，而OPLS-DA 能够滤除干扰分类的杂峰，更有效地实现数据分离 1 材料与方法 1.1 试剂和仪器 硝酸银(AgNO3)和二水合柠檬酸钠，购自上海阿拉 丁 生 化 科 技 股 份 有 限 公 司；盐 酸 羟 胺(NH2OHHCl)和氯化钠(NaCl)，购自天津希恩思生化科技有限公司；氢氧化钠(NaOH)，购自天津市元立化工有限公司；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，购自上海麦克林生化科技有限公司；氨水(NH4OH)，购自天津市江天化工技术股份有限公司；硼氢化钠(NaBH4)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；纯净水，购自杭州娃哈哈集团有限公司 TGL-16G 高速离心机，上海安亭科学仪器厂；TU-1900 双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；纳米粒度电位仪(Zetasizer Nano ZS)，英国马尔文仪器有限公司；LabRAM HR Evolu-tion 激光共聚焦拉曼光谱仪，堀场(中国)贸易有限公司；JEM-2100F 场发射透射电子显微镜，日本电子公司；JEM-1400 Flash 透射电子显微镜，日本电子公司；HZQ-F160 全温振荡培养箱，苏州培英实验设备有限公司；SW-CJ-1FD 洁净工作台，苏州安泰空气技 2023 年 10 月 齐 崴等：表面增强拉曼光谱法对食源性致病菌的鉴别 1005 术有限公司 1.2 细菌培养 本实验所用的菌株由天津大学酶工程课题组以及天津大学食品生物技术实验室提供，-20保存于20%甘油中 菌株接种于 LB 培养基(蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L)，在 37摇床中以220r/