METTL3通过m6A修饰β-catenin影响顺铂诱导肺癌细胞DNA损伤的修复.pdf

第5 2卷第4期第4 8 2页2 0 2 3年8月 华中科技大学学报(医学版)A c t aM e dU n i vS c iT e c h n o lH u a z h o n g V o l.5 2 N o.4 P.4 8 2A u g.2 0 2 3*武汉市卫生健康委员会重点项目(N o.WX 2 0 B 0 4)徐建群,女,1 9 8 0年生,主治医师,E-m a i l:3 7 5 7 3 8 9 7 7 q q.c o m通讯作者,C o r r e s p o n d i n ga u t h o r,E-m a i l:2 8 6 5 7 2 3 3 1 2q q.c o mME T T L 3通过m 6 A修饰-c a t e n i n影响顺铂诱导肺癌细胞D NA损伤的修复*徐建群,周利君,程津津,方 思,王红娟,郭红荣,戴 芹武汉市第三医院呼吸内科,武汉 4 3 0 0 7 1摘要:目的 基于顺铂诱导肺癌细胞D NA损伤细胞模型,探讨甲基转移酶样3(m e t h y l t r a n s f e r a s e-l i k e3,ME T T L 3)介导的N 6-甲基腺苷(N 6-m e t h y l a d e n o s i n e,m 6 A)修饰-c a t e n i n在肺癌中的作用机制。方法 通过顺铂诱导,建立A 5 4 9细胞D NA损伤模型,再接受合成ME T T L 3s i R NA和s i R NA空载质粒(N C)转染。将细胞分成对照组、顺铂诱导组、顺铂诱导+s i R NA组、顺铂诱导+N C组,C C K-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,q R T-P C R和W e s t e r nb l o t检测ME T T L 3m R NA和蛋白表达,W e s t e r nb l o t检测各组细胞中-c a t e n i n、H 2 A X、E R C C 1、N D R G 1和A TM的蛋白表达,m 6 AR NA甲基化定量试剂盒测定R NA中m 6 A的水平。结果 成功转染ME T T L 3s i R NA后,A 5 4 9细胞中ME T T L 3m R NA表达降低(P0.0 1)。与对照组相比,顺铂诱导组细胞增殖能力下降(P0.0 1),凋亡率上升(P0.0 1),细胞周期G0G1期延长,S期和G2M期均缩短(均P0.0 1),ME T T L 3m R NA和蛋白表达水平下调(均P0.0 1),H 2 A X、E R C C 1、N D R G 1蛋白表达上升(均P0.0 1),A TM和-c a t e n i n蛋白表达下降(均P0.0 1),m 6 A水平显著下调(P0.0 1);与顺铂诱导组相比,顺铂诱导+s i R NA组上述趋势更加显著;而顺铂诱导+N C组细胞与其差异无统计学意义。结论 ME T T L 3敲低通过m 6 A修饰-c a t e n i n抑制顺铂诱导肺癌细胞D NA损伤的修复。关键词:肺癌;顺铂;甲基转移酶样3;N 6-甲基腺苷;D NA损伤中图分类号:R 7 3 4.2 D O I:1 0.3 8 7 0/j.i s s n.1 6 7 2-0 7 4 1.2 0 2 3.0 4.0 0 8ME T T L 3M o d i f i e d-c a t e n i nb ym 6 At oA f f e c tC i s p l a t i n-i n d u c e dD N AD a m a g eR e p a i r i nL u n gC a n c e rC e l l sX uJ i a n q u n,Z h o uL i j u n,C h e n gJ i n j i ne t a lD e p a r t m e n t o fR e s p i r a t o r yM e d i c i n e,W u h a nT h i r dH o s p i t a l,W u h a n4 3 0 0 7 1,C h i n aA b s t r a c t O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h em e c h a n i s mo fm e t h y l t r a n s f e r a s e-l i k e3(ME T T L 3)m e d i a t e dN 6-m e t h y l a d e n o s i n e(m 6 A)m o d i f i c a t i o no f-c a t e n i ni nl u n gc a n c e rb a s e do nc i s p l a t i n-i n d u c e dD NAd a m a g em o d e lo f l u n gc a n c e rc e l l s.M e t h o d s T h eD NAd a m a g em o d e l o fA 5 4 9c e l l sw a s c o n s t r u c t e db y c i s p l a t i n-i n d u c t i o n,a n d t h e n i tw a s t r a n s f e c t e dw i t hs i R NA ME T T L 3a n dn o-l o a d(N C)p l a s m i d.C e l l sw e r ed i v i d e d i n t oc o n t r o l g r o u p,c i s p l a t i n-i n d u c e dg r o u p,c i s p l a t i n-i n d u c e d+s i R NAg r o u p,a n dc i s p l a t i n-i n d u c e d+N Cg r o u p.C e l lp r o l i f e r a t i o nw a sd e t e c t e db yC C K-8;c e l l a p o p t o s i sa n dc e l l c y c l ew e r ed e t e c t e db yf l o wc y-t o m e t r y;m R NAa n dp r o t e i ne x p r e s s i o no fME T T L 3w e r ed e t e c t e db yq R T-P C Ra n dW e s t e r nb l o t t i n g.T h ep r o t e i ne x p r e s s i o n so f-c a t e n i n,H 2 A X,E R C C 1,N D R G 1a n dA TMi ne a c hg r o u pw e r ed e t e c t e db yW e s t e r nb l o t t i n g;a n dt h eo v e r a l l l e v e l o fm 6 Ai nR NAw a sd e t e r m i n e db ym 6 AR NA m e t h y l a t i o nq u a n t i f i c a t i o nk i t.R e s u l t s A f t e rs u c c e s s f u l t r a n s f e c t i o no fME T T L 3s i R-NA,e x p r e s s i o no fME T T L 3w a sd e c r e a s e d i nA 5 4 9c e l l s(P0.0 1).C o m p a r e dw i t hc o n t r o l g r o u p,c e l l p r o l i f e r a t i o na b i l i t yw a sd e c r e a s e d(P0.0 1),a p o p t o s i s r a t ew a s i n c r e a s e d(P0.0 1),c e l l c y c l eG0G1p h a s ew a sp r o l o n g e d,Sp h a s e a n dG2Mp h a s ew a ss h o r t e n e d(a l lP0.0 1),ME T T L 3m R NAa n dp r o t e i ne x p r e s s i o n l e v e l sw e r ed o w n r e g u l a t e d(b o t hP0.0 1)i nc i s p l a t i n-i n-d u c e dg r o u p.T h ep r o t e i ne x p r e s s i o n so fH 2 A X,E R C C 1a n dN D R G 1w e r e i n c r e a s e d(a l lP0.0 1);a n dt h ep r o t e i ne x p r e s s i o n so fA TMa n d-c a t e n i nw e r ed e c r e a s e d(b o t hP0.0 1),a n d t h e l e v e l o fm 6 Aw a s s i g n i f i c a n t l yd o w n r e g u l a t e d(P0.0 1)i nc i s p l-a t i n-i n d u c e dg r o u p.C o m p a r e dw i t hc i s p l a t i n-i n d u c e dg r o u p,c i s p l a t i n-i n d u c e d+s i R NAg r o u ps h o w e dam o r es i g n i f i c a n tt r e n d,b u t t h e f l u c t u a t i o n i nc i s p l a t i n-i n d u c e d+N Cg r o u ps h o w e dn os t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e.C o n c l u s i o n ME T T L 3k n o c k d o w n i n h i b-i t sc i s p l a t i n-i n d u c e dD NAd a m a g er e p a i r i n l u n gc a n c e rc e l l s t h r o u g hm 6 A m o d i f i c a t i o no f-c a t e n i n.K e yw o r d s l u n gc a n c e r;c i s p l a t i n;m e t h y l t r a n s f e r a s e-l i k e3;N 6-m e t h y l a d e n o s i n e;D NAd a m a g e 肺癌是最常见的癌症之一,其发病率和死亡率均居恶性肿瘤之首1。非小细胞肺癌(N S C L C)占所有肺癌的8 5%,包括两种主要病理类型:腺癌和鳞状细胞癌2。手术、化疗、放疗、靶向、免疫治疗等方法可以延长肺癌患者的生存时间,但其5年生存率仍然仅为1 5%3。D NA损伤修复对于维持细胞正常的生 理活动至关 重要,调控细 胞周期阻滞、D NA修复、衰老和凋亡4-5,其异常可导致多种病理结果。研究发现,调节细胞N 6-甲基腺苷(m 6 A)水平,能够诱导包括D NA损伤修复相关基因的差异化表达6。m 6