LncRNA NNT-AS1通过miR-582-5p_MCL1对肝癌细胞侵袭和转移的影响.pdf

基础研究 通过 对肝癌细胞侵袭和转移的影响孙波，周雷，周东亚，王小龙，徐超，吕莹，刘?（南京中医药大学沭阳附属医院 肿瘤科，江苏 宿迁 ）摘要目的探讨 通过 轴对肝癌的侵袭和转移的影响。方法培养正常肝 细胞和肝癌细胞 、，选取肝癌 细胞系，将细胞进行分组与转染；采用 检测各组细胞中 、表达，检测各组细胞 蛋白表达，检测 和 的结合情况，双荧光素酶报告基因实验验证 和 靶向关系，实验检测细胞侵袭和转移能力。结果与正常肝细胞 比较，在肝癌细胞系中高表达，在肝癌细胞系中低表达；和 沉默后，细胞中 和 表达显著降低，细胞侵袭和转移能力也明显减弱；可结合吸附 ，是 的下游靶基因、且 在肝癌细胞系中高表达；干扰 或过表达 表达可抑制肝癌细胞侵袭和迁移；同时沉默 和过表达 ，可显著降低细胞侵袭和迁移能力；干扰 也可抑制肝癌细胞侵袭和迁移能力增强的现象。结论沉默 可通过 作用，抑制 表达从而抑制肝癌细胞侵袭和转移。关键词 反义核糖核酸 ；微小核糖核酸 ；髓细胞白血病 ；肝肿瘤；侵袭；转移 中图分类号 文献标识码 文章编号 （）：，（，），第 卷第 期 年 月贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目 国家中医药管理局重点研究室开放课题（）；宿迁市科技计划项目（）引用本文：孙波，周雷，周东亚，等 通过 对肝癌细胞侵袭和转移的影响 贵州医科大学学报，（）：，；肝癌是全球最常见的癌症死亡原因之一，也是中国第 大最常见的癌症死亡原因 。肝癌的预后很差，即使经过手术切除和标准化治疗，其复发率和转移率仍然很高 。因此，深入研究肝癌防治的新靶点，对提高肝癌的早期诊断和临床预后具有重要意义。长非编码 （）是一类非蛋白质编码 转录物，长度超过 个核苷酸，被认为是癌症生物学中的新型调控因子 。异常表达的 通过转录或转录后基因调控影响癌细胞的增殖、转移、自我更新和凋亡，促进多种癌症类型的发生发展 。有证据表明 可能是癌症检测的有效生物标志物，包括肝癌在内的多种癌症类型的致瘤性都涉及各种 。其中，是一种新鉴定的 ，位于 个外显子的 处，被认为是肝癌致癌基因 。在肝癌发展中的机制研究极为匮乏。通过降低其靶 的水平在人类肿瘤中发挥作用已被广泛接受。据报道，通过抑制 增强肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭 。此外，牛磺酸上调基因 通过海绵 促进肝癌进展 。有研究表明，在肝癌中表达降低 ，是否通过调控 来影响肝癌进展仍不明确。是抗凋亡 家族蛋白的关键成员，的独特之处在于其有效的泛素化和破坏作用，并且具有促进肿瘤侵袭和转移的功能 。目前 在肝癌进展中的作用机制还不明确，是否由 介导和调节也不清楚。因此本研究旨在探讨 、和 对肝癌细胞侵袭和转移的影响。材料与方法 细胞培养选择正常肝细胞 细胞和肝癌细胞 、（购 于 ，中国）进行培养。置于 、细胞培养箱（型号 ，美国）中，用含 胎牛血清（，美国）的 培养基（，美国）培养，每天更换培养基，传代。选择处于对数生长期并且生长状态较好的细胞进行实验。细胞分组及转染取对数期生长的人肝癌 细胞系 按 孔密度接种于 孔培养板内，转染前 用不含血清和双抗的 培养基培养将细胞分组并转染：组（不做处理细胞）、组、组、组、组、组、组、及 组，按照 说明书进行转染，将 、或 （上海吉玛公司，中国）快速离心，与 磷酸盐缓冲液（赛默飞世尔，）混匀后，静置 ，加入 （，美国），轻微震荡充分混匀后，室温下静置 ，添加后加入到 孔板中，轻轻混匀，换为含 胎牛血清的培养基（，美国）。转染 后，收集细胞用于后续实验。观察指标 检 测 、表达水平收集转染 后的各组细胞，（货号 ，赛默飞世尔科技，纽约，美国；货号 ，哈尔滨新海基因检测有限公司，中国）提取总 。（公司，）逆转录合成 。试剂盒（行知生物科技有限公司，中国）进行荧光定量 检测。依次加入以下组分：（），上、下游引物各 ，（），模板 ，。在 （型号 ，上海坤科仪器设备有限公司，中国）系统进行荧光定量 。反应条件：预贵 州 医 科 大 学 学 报 卷变性 ，变性 ，退火 ，循环 次后 延伸 。（目的基因）（），（实验组）（对照组），基因以 为内参，用 表示各目的基因相对表达量。引物见表 。表 引物序列 名称方向序列 正向引物 反向引物 正向引物 反向引物 正向引物 反向引物 正向引物 反向引物 正向引物 反向引物 检测 蛋白表达细胞转染培养 后，预冷的 洗 遍，使用含 的 裂解液（，）提取细胞中总蛋白。试剂盒（，美国）测定蛋白浓度，去离子水调零。样品与上样缓冲液混合，金属浴煮 ，点样时加入 蛋白样品，以 恒压电泳 。湿转法将蛋白转移至 膜（，）上，恒流 转膜。脱脂奶粉 室温封闭；弃去牛奶，洗去牛奶，用一抗兔抗人 （，）、（，）孵育过夜，洗 次，每次 。标记的羊抗兔 抗体（北京中山生物技术有限公司，稀释）孵育。洗 次、每次 ，洗后泡在 中。取 荧光检测试剂盒（货号 ，公司，英国）中 液和 液，等体积混匀，滴加在膜上，在凝胶成像仪中曝光成像。用 图象分析系统（美国 公司）照相，用 软件分析，以相应蛋白条带的灰度值 蛋白条带的灰度值表示相对蛋白含量。检测 和 结合采用 试剂盒（，）检测 和 结合情况。用预冷 洗神经元后弃上清。用等体积的 裂解液（，碧云天）冰浴 裂解细胞，离心 取上清。细胞提取液一部分取出作为 ，一部分与抗体孵育进行共沉淀。具体步骤：每一个共沉淀反应体系取 磁珠清洗后重悬于 中，依据实验分组加入 抗体孵育以便结合。磁珠 抗体复合物经清洗后与重悬于 ，加入 细胞提取液 孵育过夜。样品置于磁座上收集磁珠 蛋白复合物。样品及 分别经蛋白酶 消化后提取 ，检测 和 结合。所用抗体为：（，），室 温 混 匀 ，（，）作为阴性对照。生物信息学网站和双荧光素酶报告基因实验首先经过生物学预测网站（）进行 与 结合位点的分析。接下来通过双荧光素酶报告系统验证 与 的靶向关系。构建靶基因 双荧光素酶报告基因载体与 结合位点突变的突变体：和 。将 质粒和两种报告质粒分别与 和 质粒共转染到 细胞中。将 质粒和两种报告质粒分别与 质粒和 质粒共转染到 细胞中，在细胞转染 后，进行双荧光素酶检测。首先将各组细胞裂解，裂解后以 离心 ，去沉淀，收集上清液。双荧光素酶报告试剂盒购自 ，按照试剂盒操作，测量荧光素酶活性。操作步骤如下：将裂解后的细胞样品吸入 管中，每 样品中萤火虫荧光素酶工作溶液 ，测得萤火虫荧光素酶之后加入海肾荧光素酶工作溶液 ，测得海肾荧光素酶结果。相对荧光素酶活性 萤火虫荧光素酶 海肾荧光素酶。检测细胞迁移和侵袭能力采用 培养系统检测细胞的迁移和侵袭能力。使用涂有 （，）的上腔室的透孔膜；在 的培养箱中，用无血清培养基将小室再水化。随后将顶部室用 细胞悬浮液（含有 个细胞）水合。在底部室中加入 含有 作为化学吸引剂的培养基。在 下培养 后，将膜下表面的跨膜细胞在室温下用甲醛固定 ，用结晶紫染色 ，用清水洗涤次，并在显微镜下计数。期孙波等 通过 对肝癌细胞侵袭和转移的影响 统计学分析所有数据均采用 统计学软件进行处理，计量资料采用均值 标准差（）表示，多组之间比较采用 单因素方差分析，多组间均值两两比较采用 检验。表示差异有统计学意义。结果 肝癌细胞系中 和 表达 结果显示，与肝细胞 比较，、细胞中 表达升高，表达降低，差异有统计学意义（）；其中 细胞中 表达量最高，选择该细胞进行后续实验。见图。沉默 和过表达 对肝癌细胞株 侵袭和转移的影响为探究 对肝癌细胞株 侵袭和转移的影响，分别对 细胞进行 和 沉默和过表达处理，并通过 检测各组细胞的侵袭和转移情况。结果显示，与 组比较，组细胞侵袭和转移能力显著降低，差异有统计学意义（）；与 组比较，组细胞侵袭和转移能力显著降低，差异有统计学意义（）。见图 。注：（）与肝细胞 比较，。图 肝细胞和肝癌细胞中 和 表达 注：为 转移与侵袭图（结晶紫染色，），为各组细胞转移细胞数量统计分析，为各组细胞侵袭细胞数量统计分析；（）与 组比较，；（）与 组比较，。图 检测沉默 和过表达 对肝癌细胞 侵袭和转移 贵 州 医 科 大 学 学 报 卷 对海绵 的吸附情况通过生信筛选发现 和 存在结合位点。为探究 和 之间的关系，实验验证 与 的结合能力（图 ）；与 （）比较，（）结合的 的量显著增多，差异有统计学意义（），提示 可海绵吸附 。吸附 在肝癌细胞株 侵袭和转移的影响 检测各组肝癌细胞株 的侵袭和转移情况，结果显示，与 比较，组 细胞侵袭和转移能力显著减弱，组 细胞侵袭和转移能力显著降低，差异有统计学意义（）；与 比较，组 细胞侵袭和转移能力显著降低，差异有统计学意义（）。见图 。靶向结合 生信网站分析发现 与 存在结合位点。双荧光素酶报告检测发现，与突变的 的 共转染后差异无统计学意义（），而 与野生型的 的 共转染后萤光素酶活性明显降低，差异有统计学意义（）。见图 。结果提示，是 的下游靶基因。对 表达的影响 结果显示，与 （）组比较，（）组 细胞中 表达明显下调，差异有统计学意义（）。注：为 转移与侵袭图（结晶紫染色，），为各组细胞转移细胞数量统计分析，为各组细胞侵袭细胞数量统计分析；（）与 组比较，；（）与 组比较，。图 检测 吸附 对肝癌细胞株 侵袭和转移 期孙波等 通过 对肝癌细胞侵袭和转移的影响注：（）与 组比较，。图 与 之间的靶向关系 肝癌细胞系中 表达 结果显示，与肝细胞 比较，、细 胞 表达明显升高，差异有统计学意义（）。见图 。在肝癌细胞的侵袭与转移中的作用将肝癌细胞株 中 沉默后，再将 过表达，采用 检测沉默 后细胞的侵袭和转移情况。结果显示，与 组比较，组 细胞侵袭和转移能力显著增强，差异有统计学意义（）。见图 。提示 能够恢复 沉默对肝癌细胞的侵袭和转移能力的抑制。注：为各组细胞 的蛋白条带图，为各组细胞 的蛋白水平统计图；（）与肝细胞细胞 比较，。图 肝细胞和肝癌细胞中 的表达 注：为 转移与侵袭图（结晶紫染色，），为各组细胞转移细胞数量统计分析，为各组细胞侵袭细胞数量统计分析；（）与 组比较，。图 检测沉默 后肝癌细胞株 侵袭和转移 贵 州 医 科 大 学 学 报 卷 讨论肝癌细胞具有很强的转移能力，并且在早期阶段患者是没有明显症状的，一般发现时已有伴有淋巴结远处转移 。而肝癌的致病原因难以追踪，因而探究肝癌发生进程中的分子机制以及研发出具有广谱性的分子靶点和治疗药物是目前亟待解决的问题。随着高通量 测序和生物信息学分析的发展，已经报道了许多新发现的 在多种肿瘤发生过程中起癌基因或抑癌作用。例如，在肝癌组织和细胞系中显着上调，并通过抑制 促进肝癌细胞增殖，侵袭和迁移 。在肝癌组织和细胞中被下调，而 的表达增强可以抑制 信号和上皮 间质转化 。是细胞正常发育过程中决定细胞命运的重要因素 ，是一种独特的抗凋亡 家族蛋白，在控制癌细胞凋亡和生存方面起着看门人的作用，目前已在多种癌症中观察到 受体及其配体在肿瘤细胞中异常高表达 。目前多个报道证实，在癌症中异常高表达，且通过吸附 ，调节下游靶基因的表达，对肿瘤细胞生命活动发挥其影响。本研究选择正常肝细胞 细胞和肝癌细胞株 、，检测 在正常细胞和 种肝癌细胞中的表达，发现 在五种癌细胞中较正常细胞表达明显较高。根据文献调研和生信分析，可结合并吸附 ，通过实验发现，在种癌细胞中较正常细胞表达明显较低，随后干扰 并且过表达 发现肝癌细胞 的侵袭和转移能力明显被抑制，且同时作用时，抑制作用更强。为进一步探讨 下游的调控机制，通过生信预测到 是 的下游靶基因，并且从多个已发表文献来看，在肿瘤中高表达，通过双荧光素酶报告基因实验验证 是 的下游靶基因，两者之间确实存在靶向关系，并且通过将肝癌细胞株 中 沉默后，将 过表达，发现 能够恢复肝癌细胞 的侵袭和转移能力。这与之前所报导的文献结果一致。本研究证明 可结合并吸附 介导 来抑制肝癌细胞的侵袭和转移。此次研究，进一步阐明了肝癌的发展机制和分子网络，为临床肝癌的靶向治疗和分子药物的研发奠定了理论基础。为进一步确认以上结果，还需进一步进行 的功能回补实验和动物实验。