SIK2通过Akt_mTOR转导途径调节细胞自噬对减轻心肌缺血_再灌注损伤的研究.pdf

mCor.S实验研究联勤军事医学2 0 2 3年6 月2 8 日第37 卷第6 期Mil Med JntLog,Vol.37,No.6,June28,2023455SIK2通过Akt/mTOR转导途径调节细胞自噬对减轻心肌缺血/再灌注损伤的研究朱涛，张为民，阿不都乃比麦麦提艾力，刘正，艾克热木吐尔逊，霍强【摘要】目的探讨盐诱导激酶2(salt induceskinase 2，SIK 2)对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的调控作用，及对蛋白激酶B(proteinkinaseB，A k t）)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetof rapamycin，mT O R）通路的影响。方法将15只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组（心肌缺血/再灌注损伤模型）、SIK2抑制剂组（造模前2 4h给予10 mg/kg博舒替尼），每组5只大鼠。采用超声仪检测大鼠心脏功能，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，H E）染色评估心肌组织病理学情况，透射电镜观察心肌细胞自噬情况，Westernblot检测心肌组织Akt/mTOR通路（SIK2、p-A k t、A k t、p-m T O R、mTOR)以及自噬(Beclin-1、LC3-I I/LC3-I、p 6 2)相关蛋白表达水平。结果3组大鼠左心室后壁厚度（leftventricularposteriorwall,LVPW）、室间隔（interventricularseptum,IVS）组间比较差异无统计学意义（P0.05），SIK 2 抑制剂组左心室短轴缩短率（leftventricularfractionshort，LVFS）以及左心室射血分数（leftventricularejectionfractions，LVEF）均高于模型组、低于假手术组（P均 0.0 1)，模型组LVFS、LVEF均低于假手术组（P均 0.0 1)。与假手术组比较，模型组心肌组织病理损伤明显，自噬小体明显增加，SIK2抑制剂组心肌组织病理损伤、心肌细胞自噬情况较模型组明显改善。SIK2抑制剂组Beclin-1、LC3-I I/LC3-I 蛋白表达量低于模型组、高于假手术组，p62蛋白表达量高于模型组、低于假手术组（P均 0.0 5），SIK2抑制剂组SIK2水平高于假手术组、低于模型组，而p-Akt、P-m T O R水平高于模型组，模型组p-Akt、p-m T O R水平低于假手术组（P均0.05),the left ventricular fraction short(LVFS)and left ventricu-【基金项目】国家自然科学基金资助项目（8 2 0 6 0 90 7）【作者单位】830054新疆乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院心脏外科(朱涛、张为民、阿不都乃比麦麦提艾力、刘正、艾克热木吐尔逊、霍强）【通信作者】霍强强,E-mail:lar ejection fractions(LVEF)in the SIK2 inhibition groupwere higher than those in the model group and lower thanthose in the sham surgery group(all P0.01),LVFSand LVEF in model group were lower than those in thesham surgery group(all P0.01).Compared with thesham surgery group,the pathological injury of myocardialtissue were obvious and autophagy of myocardial cells sig-MilMedJntLog0.6,June28,2023联勤军事医学2 0 2 3年6 月2 8 日第37 卷第6 期456nificantly increased in the model group,while the pathological injury of myocardial tissue and autophagy of myocardialcells in the SIK2 inhibition group were significantly improved.The protein expression levels of Beclin-1,LC3-II/LC3-Iin SIK2 inhibition group were lower than those in model group and higher than those in sham surgery group,while theprotein expression levels of p62 were higher than those in model group and lower than those in sham surgery group(all P0.05),the level of SIK2 in the SIK2 inhibition group was higher than that in the sham surgery group but lower than thatin the model group,while the level of p-Akt and p-mTOR was higher than that in the model group,and the levels ofp-Akt and p-mTOR in the model group were lower than those in the sham surgery group(all P0.05).Conclusion In-hibition of SIK2 can reduce abnormal autophagy of myocardial cells and improve myocardial ischemia/reperfusion injury,its mechanism may be related to the regulation of Akt/mTOR signaling pathway by SIK2.【K e y w o r d s Protein kinase B/mammalian target of rapamycin signaling pathway;Myocardial ischemia/reperfusioninjury;Autophagy;Myocardial injury;Salt induces kinase 2自噬在心肌缺血/再灌注损伤中发挥重要调控作用，过度自噬会诱导心肌细胞损伤、调亡，从而破坏心脏结构和功能，进而引发缺血/再灌注损伤1-3。蛋白激酶B(proteinkinaseB,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mam-malian target of rapamycin，mT O R）信号通路是调控自噬的关键通路,其中mTOR是细胞生长、增殖、自噬的调控中心，通过调控ULK1-ATG13-FIP200蛋白复合物启动，诱导自噬疾病的表达4。有研究表明，多种药物可通过调控mTOR状态而影响心肌细胞自噬，有助于改善心肌缺血/再灌注损伤5。盐诱导激酶2（salt induceskinase2，SIK 2)属于单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(adenosine5-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)家族成员，既往研究发现SIK2可调控脑组织缺血/再灌注损伤大鼠模型中的能量代谢，改善脑组织损伤，同时SIK2还能调节细胞自噬体的成熟、自噬过程6-刀。基于以上研究，本文作者认为SIK2可能通过影响自噬相关通路（Akt/mTOR信号通路)而减少心肌细胞异常自噬，改善心肌缺血/再灌注损伤。因此，本次研究将建立心肌缺血/再灌注损伤大鼠模型进行论证。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1实验动物15只成年雄性SD大鼠，12 15周龄，体质量2 0 0 2 50 g，购自北京维通利华公司许可证号：SYXK（京）2 0 2 2-0 0 52 。大鼠置于SPF级实验动物中心通风饲养，室内温度为（2 12)，相对湿度为40%6 0%，自由饮水、进食。1.1.22主要试剂0.9%氯化钠注射液购自于石家庄第四制药厂；Beclin-1、LC3-II/LC3-I、p 6 2 兔抗大鼠IgG购自美国Abcam公司；兔多克隆抗体p-Akt、Akt、p-mT O R、mT O R、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)购 自于美国Cell SignalingTechnology公司；磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline,PBS）、二甲基亚矾、乌拉坦等均购自于Sigma公司SIK2抑制剂（博舒替尼）、放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitationas-say,RIPA)裂解液、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自于碧云天生物技术有限公司；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，H E)染色液购自于北京索莱宝科技有限公司；化学发光试剂购自美国Millipore公司。1.1.3主要仪器设备超声仪器为PhilipsEPIQ7C,探头L12-3；小动物呼吸机（HX-101E）、心电图机（BL-420S)购自成都泰盟软件有限公司；凝胶电泳系统购自美国Bio-Rad公司；各种型号显微镜购自Carl-Zeiss公司。1.2动物分组与模型的建立大鼠适应7 天后随机分为假手术组、模型组和SIK2抑制剂组，每组5只。假手术组：缝线穿过冠状动脉左前降支但不结扎；模型组：缝线结扎冠状动脉左前降支，30 min后松开结扎线再灌2 h；SI K 2 抑制剂组：造模前2 4h于左股静脉注射博舒替尼10 mg/kg（生理盐水溶解），模型组、SIK2抑制剂组2 4h后建模。具体建模过程如下：术前12 h禁食，自由饮水，称重后于腹腔注射5ml/kg、2 5%乌拉坦，待麻醉起效后仰卧位固定大鼠于恒温鼠板上，酒精消毒，记录正常心电图。颈正中开切口，分离颈部气管，气管插管，连接呼吸机通气。左侧34肋间开胸，缝线结扎冠脉左前降支（假手术组不结扎），复位心脏位置，挤出胸腔内空气，关闭胸腔即可。心电图显示ST段抬高或下降0.2mV则表明造模成功，缺血30 min后打开胸腔，松开结扎线，缝合胸部皮肤，再灌2 h。1.3观察指标1.3.1大鼠心脏功能大鼠于麻醉状态下至少检测3个连续、完整的心动周期，获取超声心动图参数，包括左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall，LVPW）、室间隔（interventricular septum,IVS)、左心室短轴缩短率（left ventricular fraction short,LVFS)以及左心室射血分数（leftventricularejection frac-联勤军事医学2 0 2 3年6 月2 8 日第37 卷第6 期Mil Med Jnt Log,Vol.37,No.6,June28,2023457tions,LVEF)。1.3.2心脏病理学采用HE染色法评估心脏病理学情况，断头处死大鼠，取心脏，4%多聚甲醛中固定2 4h，脱水、包埋、切片、染色等操作。从心尖部开始分割成3等份，厚度均为2 3mm,脱水处理;HE染液、梯度乙醇分别将心肌细胞的细胞核、细胞质染成蓝色、红色，中性树胶封片，光学显微镜下观察细胞形态、结构。1.3.3心肌细胞自噬情况取大鼠左心室心尖部组织，体积约1mm，固定液固定2 4h，常规脱水、浸透、包埋、染色，制成50 7 0 nm切片，透射电镜下观察心肌组织自噬情况