NSUN2对阿霉素诱导H9C2细胞损伤的作用及机制.pdf

论著：引用本文格式：郑丽娜，王 洁，程 飞，等 对阿霉素诱导 细胞损伤的作用及机制湖北医药学院学报，（）：对阿霉素诱导 细胞损伤的作用及机制郑丽娜，王 洁，程 飞，陈佳娟，丁 妍，王治校（湖北医药学院附属太和医院心内科，湖北 十堰）摘 要 目的：探讨 对阿霉素（，）诱导 细胞损伤的作用及可能机制。方法：细胞分两组，对照组（加入 氯化钠溶液 ）和 组（加入用 氯化钠溶液配置成 阿霉素、转染 细胞、腺病毒转染人源 建立 稳定过表达 细胞系，加入阿霉素 共培养 后，用 探针、免疫荧光、染色等方法检测细胞的活性氧（）、凋亡及 的变化，检测细胞培养基上清内 表达变化。结果：结果显示，组与对照组比较，细胞 蛋白水平及 表达水平升高（），蛋白水平下降（）；检测细胞培养液内 表达水平 组较对照组升高（）；结果显示 组细胞凋亡明显增加；探针检测 组细胞内 水平较对照组明显升高；细胞敲减 后，组细胞内 蛋白水平较对照组升高（），蛋白表达水平下降（）；过表达时，组与对照组比较，细胞内 表达水平下降（），表达水平升高（）。结论：能抑制阿霉素诱导的 细胞损伤，对其 细胞起保护作用，机制可能与 抗氧化应激相关。关键词；阿霉素；细胞；活性氧基金项目 国家自然科学基金面上项目（）；湖北省自然科学基金创新群体项目（）作者简介 郑丽娜（），女，湖北十堰人，学士，助教，研究方向：老年医学。通信作者 王治校（），男，湖北监利人，医学博士，副教授，研究方向：衰老相关心血管疾病及冠心病基础和临床。：，（，）：（），（）（），（），（）（），（），（），（）（）湖北医药学院学报（）网址：年 月，（）：；阿霉素（，）又名盐酸多柔比星，属于非选择性型蒽环类化疗药物，临床上常用于急性白血病、软组织肉瘤、乳腺癌等多种肿瘤的一线化疗方案。除常见的胃肠道反应、骨髓抑制、肝肾毒性等不良反应外，心脏毒性是其最严重的不良反应。有研究表明，阿霉素引起心脏毒副反应的机制有活性氧自由基诱发的氧化应激增强、钙超载和能量代谢障碍等导致的线粒体损伤、毒性代谢产物的生成以及铁死亡等，最终引起心肌细胞凋亡或凋亡加速。细胞是一种小鼠心肌细胞系，具有原代心肌细胞相似的生理特性和代谢特征，对外界刺激和药物反应具有高度一致性和可重复性，因此最常用于心血管药物筛选和疾病模型研究。甲基转移酶家族成员（，）是一种实施 甲基化修饰的甲基转移酶，参与细胞增殖、分化与迁移等生物过程。研究表明：在哺乳动物的线粒体中，促进 甲基胞嘧啶（）生成和表达，与细胞的增殖和生长、干细胞的分化、恶性肿瘤的发生发 展 等 密 切 相 关。目 前 关 于 与 细胞相关研究甚少，本研究拟通过阿霉素诱导构建 细胞损伤模型，探究 对阿霉素诱导引起 细胞损伤的作用及可能机制，以期为阿霉素诱导心肌细胞及心脏损伤的防治提供新的理论依据。材料和方法 细胞 细胞由湖北医药学院胚胎干细胞湖北省重点实验室惠赠。主要试剂 检测液、底物反应液（碧云天），染色液（），胚胎干细胞湖北省重点实验室内液氮罐冻存的 细胞，腺病毒（唯真生物），盐酸阿霉素（），合成预混液（）（），、抗体（），抗体（碧云天）。主要方法实验细胞及分组 细胞分两组，组和对照组；组（空白对照）和 组（利用 干扰 表达）；组和 组。细胞阿霉素损伤模型建立复苏培养的 细胞长满后铺板至 孔板，密度达 以上后，组加入用 氯化钠溶液配置成 阿霉素 ，与细胞完全培养液充分混匀；对照组加入 氯化钠溶液，与细胞完全培养液充分混匀，在、饱和湿度细胞培养箱内继续培养 用于下一步实验。稳转细胞珠构建将细胞状态良好的 细胞铺入 孔板，待细胞密度达 后，组加入 空载病毒液，组加入 已包装好的 过表达病毒液，后可在荧光显微镜下观察到细胞内绿色荧光，后细胞内绿色荧光率超过，添加嘌呤霉素 进行筛选 代，设置未感染细胞做筛选结束标志，未感染细胞全部凋亡后终止筛选，继续培养增殖传代用于后续实验，并冻存一部分细胞于液氮内保存，待细胞内 稳定表达后收集细胞提取 和蛋白，通过 和 检测过表达效率。细胞 凋亡检测提前将 细胞铺板至已放入无菌细胞爬片的 孔板，、饱和湿度培养箱内培养，加入 缓冲液洗涤 次，加 多聚甲醛固定 ，吸去多聚甲醛后用 缓冲液洗涤 次，每次 ，加入含 的 缓冲液，室温孵育，缓冲液洗涤 次后加入 检测液，充分混匀后滴加在标本上，避光孵育 ，将细胞爬片放置在湿盒内以防止检测液蒸发。孵育结束后 缓冲液洗 次，每次 ，加入 染色液常温避光反应，再次用 缓冲液洗涤 次，每次 ，尽可能吸干水分后滴加抗荧光猝灭封片液封片并及时在荧光显微镜下观察。检测 细胞增殖将 野生型细胞均匀铺板至 孔板，组和 组每个时间均各设置 个复孔，待密度到 时，转染细胞，后（此时细胞密度约）开始按时间设置、每孔加入 试剂，培养箱继续培养 后检测 的吸光值。同上述步骤，将 组细 郑丽娜，等 对阿霉素诱导 细胞损伤的作用及机制胞和 组通过牛鲍细胞计数板计数后均匀铺板至 孔板，组和 组每个时间均各设置 个复孔，待密度达到时开始按时间设置、每孔加入 试剂，培养箱继续培养 后检测 的吸光值。统计学分析本实验全部采用 对数据进行分析并作图。所有数据均采用 表示，样本符合正态分布，两组间比较采用 检验，多组间比较采用单因素方差分析。为差异有统计学意义。结果 细胞 敲减、过表达效率显著对 敲减和过表达，并检测其效率。利用 转染 细胞，提取 和蛋白，用 和 对其进行效率检测，敲减效率显著（，图 ）。利用慢病毒感染 细胞并用嘌呤霉素筛选获得 稳定过表达的 细胞系，提取 和蛋白，用 和 进行效率检测，过表达效率显著（，图）。注：检测 转染后 细胞内 表达水平（），；：检测 转染后 细胞内 蛋白表达水平及统计图（），；：检测 细胞 稳定过表达后 表达水平（），；：检测 细胞 稳定过表达后 蛋白表达水平及统计图（），图 细胞 敲减、过表达效率检测 促进 细胞增殖用 检测 对 细胞增殖的影响。先用 转染 细胞，检测 沉默后对 细胞的影响，然后用 组和 组细胞检测 过表达后对 细胞的影响。结果发现：组 细胞较 组增殖慢（，图）；组 细胞较 组 细胞增殖快（，图）。阿霉素增加 细胞、凋亡和 的表达用阿霉素 剂量作用 细胞。免疫荧光检测 细胞内相关蛋白表达水平显示：与对照组相比，组细胞内 蛋白及 蛋白表达水平均升高（图）；检测细胞培养上清液内 蛋白表达水平显示 组较对照组升高（，图）；细胞凋亡染色检测 细胞凋亡显示 组较对照组细胞凋亡增加（图）；探针检测 细胞内 显示 组与对照组比较明显升高（图）。抑制阿霉素诱导的 细胞损伤在阿霉素诱导的 细胞损伤模型中，当 转染 细胞后，检测显示 组细胞内 蛋白表达水平较 组增加，蛋白表达减少（，图）；当 湖北医药学院学报（）网址：年 月，（）过表达后，检测显示 组 蛋白表达较 组减少，蛋白表达增加（，图）；凋亡染色检测提示 组细胞凋亡较 组增加，组细胞凋亡较 组减少（图）。注：检测 转染 细胞增殖，；：检测 稳定过表达 细胞增殖，图 促进 细胞增殖 注：检测阿霉素对 转染后的 细胞凋亡蛋白的变化及统计图（），；：检测阿霉素对 稳定过表达 细胞凋亡蛋白的影响及统计图（），图 抑制 诱导的 细胞损伤 讨论 作为多种临床常见肿瘤的一线化疗药物，其心脏毒性被认为是最大不良反应，能引起心脏组织肌丝断裂，心肌细胞排列紊乱，组织细胞水肿，心脏的结构和功能均可能出现异常，最终导致心力衰竭。有研究表明，作用于细胞质内线粒体，导致线粒体损伤的同时促进线粒体产生过量，过度氧化应激损伤心肌细胞，且过量 可反过来损伤线粒体，并与心肌细胞内的 相结合损伤心肌细胞，从而促进心肌细胞凋亡；引起心肌的损伤是多种病理生理机制共同参与介导的分子效应。国内外指南均推荐 在安全有效的剂量范围内使用，可采用不同的剂型以减少蓄积毒副作用，同时可以联合心肌保护治疗。右丙亚胺是目前美国 批准的唯一一个可对 心肌损伤有保护作用的药物，可抑制氧自由基损伤及 介导的 双链断裂。但有研究证明，使用右丙亚胺有新发肿瘤的风险。等证明了成纤维细胞生长因子（）可抑制氧化应激和细胞凋亡，从而防止 引起的心脏损伤和功能障碍。等发现，含 型纤连蛋白域蛋白（）和骨蛋白可显著降低经 引起的心肌细胞氧化损伤和细胞凋亡。甲基化是表观遗传学的重要组成部分，包含、等几种类型，其中的 甲基化是指 胞嘧啶的第 位 被甲基化修饰。的 修饰同 甲基化修饰一样受甲基转移酶、去甲基转移酶及结合蛋白的调控，可以影响 的稳定性、翻译保真度、细胞分化、神经系统调节、生殖系统发育和病毒活性等作用。是一种存在于 和 中的甲基化修饰。能对多种编码进行甲基化，促进或抑制细胞生长中各蛋白质的。研究表明，重组野生型 可以恢复 介导的 缺失后的 输出失调，但不能恢复甲基转移酶缺失的。等发现 介导的 甲基化调控了复制性衰老过程中 和 的水平。发现 可 增 强 郑丽娜，等 对阿霉素诱导 细胞损伤的作用及机制（细胞间黏附分子）的翻译，保护血管内皮免受炎性损伤。缺乏可降低高同型半胱氨酸引起的血管炎症，抑制主动脉瘤内皮和血浆内的 上调，抑制主动脉瘤的发生和发展。综上所述，催化的 修饰会因其位点不同而产生不同的结局，甚至是完全相反的结果，其机制有待进一步研究。我们通过构建阿霉素损伤 细胞模型，发现 诱导心肌细胞内产生过量，细胞的促凋亡蛋白 表达水平增加，抑凋亡蛋白 表达水平下降，在初期由于心肌细胞代偿，表达水平升高。沉默时，诱导 细胞的氧化损伤和细胞凋亡程度增加，过表达时，诱导 细胞凋亡降低，说明 抑制了 诱导的心肌细胞损伤。作为 甲基化修饰的主要转移酶，催化 的 甲基化修饰，那么在 心肌损伤中 是否促进了 甲基化修饰？抑或通过 进行修饰抑制 的心肌毒性？我们将进行更深入的研究，期望开发出监测阿霉素心脏损伤的新方法或抵抗 心肌损伤的药物，为临床应用 提供更多新的理论依据。（文中图，见封二）参 考 文 献，（）：，：，：，（）：，：，：，：，（）：，（），（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：湖北医药学院学报（）网址：年 月，（），（）：，（），（）：收稿日期（本文编辑：朱佩筠）（上接第 页）李丰夷，姚敦武，陈珊珊，等 工作中两种难溶性药物配置方法优化肿瘤药学，（）：方宝霞，丁 洁，陈富超，等注射用氯诺昔康在不同 值氯化钠注射液中的稳定性考察实用药物与临床，（）：陈富超，张 滔，李 鹏，等注射用氯诺昔康与芬太尼注射液配伍的稳定性医药导报，（）：，（），（）：方 静，李 彬，娄 晟，等缩短静脉用药集中调配时难溶性药物溶解时间的方法医学研究生学报，（）：陈志民，林淑瑜，谢奇恩，等静脉用难溶性药品集中调配问题分析解放军药学学报，（）：，李 睿，邱 季我院静脉用药调配中心提高调配质量和速度的举措及效果评价海峡药学，（）：王 超，谭喜莹，陈 树，等两种难溶性药物的输液调配规范药学与临床研究，（）：罗焕华，曹 侠，俞淑文，等品管圈在缩短静配中心难溶性针剂调配时间中的应用中国药事，（）：沈国荣，王 永，金唐慧，等静脉输液自动加药混合调配系统在我院静脉用药调配中心的开发与应用中国药房，（）：李苏平，吴秀萍，刘银丽，等基于质量分析法的 成品输液称质量复核管理模式的建立与实践中国药房，（）：余 茜，李广辉，彭昊帅，等我院静脉用药集中调配中心质量控制监测体系的实施与评价中国药房，（）：收稿日期（本文编辑：邴云云）郑丽娜，等 对阿霉素诱导 细胞损伤的作用及机制