miR-3133通过靶向HAS2促进人脐静脉内皮细胞自噬抑制血管生成对布加综合征的影响.pdf

第5 2卷第4期第5 0 3页2 0 2 3年8月 华中科技大学学报(医学版)A c t aM e dU n i vS c iT e c h n o lH u a z h o n g V o l.5 2 N o.4 P.5 0 3A u g.2 0 2 3*国家自然科学基金资助项目(N o.8 2 1 7 3 4 7 5);江苏省“青蓝计划”资助项目(N o.2 0 1 93)张兴海,男,1 9 9 4年生,硕士研究生,E-m a i l:1 3 7 7 6 5 8 3 7 4 41 6 3.c o m通讯作者,C o r r e s p o n d i n ga u t h o r,E-m a i l:g x s u n n y x z h m u.e d u.c nm i R-3 1 3 3通过靶向HA S 2促进人脐静脉内皮细胞自噬抑制血管生成对布加综合征的影响*张兴海,庄 玉,姜 敏,陈颜夙,孙桂香徐州医科大学公共卫生学院,徐州 2 2 1 0 0 4摘要:目的 探索m i R-3 1 3 3通过靶向透明质酸合成酶2(HA S 2)促进细胞自噬,抑制血管生成,从而影响布加综合征中隔膜形成的作用,为布加综合征的病因研究提供新的线索,寻求潜在的治疗方法。方法 利用透射电镜观察人脐静脉内皮细胞(HUV E C s)内自噬小体的数量,使用细胞自噬染色检测试剂盒,通过MD C法对细胞进行荧光染色,在荧光显微镜下观察自噬性死亡的细胞数量。通过W e s t e r nb l o t实验检测自噬标志蛋白p 6 2和L C 3的表达改变,从而验证m i R-3 1 3 3促进自噬的作用。通过C C K-8实验检测细胞的增殖能力变化,管状形成实验检测细胞形成管道能力的变化,从而验证m i R-3 1 3 3通过促进自噬抑制血管生成。利用生物信息学软件m i R a n d a进行预测,找到有可能成为m i R-3 1 3 3靶向调控对象的下游基因。转染m i R-3 1 3 3后使用W e s t e r nb l o t检测HA S 2的蛋白表达改变,从而验证m i R-3 1 3 3能够靶向负调控HA S 2。在使用小干扰R NA后,检测HUV E C s的增殖能力和血管形成能力变化以及自噬标志蛋白表达的改变,从而验证m i R-3 1 3 3是通过靶向HA S 2促进自噬抑制血管形成。结果 透射电镜结果显示转染m i R-3 1 3 3m i m i c的细胞比其阴性对照具有更多的自噬体。在荧光显微镜下m i m i c组中出现更多的MD C染色;与对照组相比,在i n h i b i-t o r组中观察到相对较少的MD C染色。C C K-8实验表明,m i R-3 1 3 3m i m i c减弱了HUV E C s的增殖,而m i R-3 1 3 3 i n h i b i-t o r促进了HUV E C s的增殖。与各对照组相比,m i R-3 1 3 3m i m i c组p 6 2蛋白表达显著下调,而m i R-3 1 3 3i n h i b i t o r组表达增加,m i m i c组L C 3-/L C 3-比值增加,而i n h i b i t o r组降低。W e s t e r nb l o t结果显示,与各自的对照组相比,m i R-3 1 3 3m i m i c组中的HA S 2表达受到抑制,而m i R-3 1 3 3 i n h i b i t o r组中的表达上调。然而,m i R-3 1 3 3未能在m R NA水平上显著调节HA S 2的表达。HUV E C s敲除HA S 2后,p 6 2蛋白表达明显降低,L C 3-/L C 3-比值升高。与阴性对照组相比,HA S 2敲除组的HUV E C s细胞增殖率和血管形成率显著降低。结论 m i R-3 1 3 3可以通过靶向HA S 2的表达,促进细胞自噬抑制血管生成,进而参与影响布加综合征。关键词:布加综合征;m i R-3 1 3 3;人脐静脉内皮细胞;自噬;血管形成中图分类号:R 6 5 7.3 4;Q 7 4 D O I:1 0.3 8 7 0/j.i s s n.1 6 7 2-0 7 4 1.2 0 2 3.0 4.0 1 1m i R-3 1 3 3P r o m o t e sA u t o p h a g yI n h i b i t i o no fA n g i o g e n e s i s i nH U V E C sb yT a r g e t i n gH A S 2a n dA f f e c t sB u d d-C h i a r i S y n d r o m eZ h a n gX i n g h a i,Z h u a n gY u,J i a n gM i ne t a lS c h o o l o fP u b l i cH e a l t h,X u z h o uM e d i c a lU n i v e r s i t y,X u z h o u 2 2 1 0 0 4,C h i n aA b s t r a c t O b j e c t i v e T oe x p l o r e t h a tm i R-3 1 3 3a f f e c t s s e p t u mf o r m a t i o n i nB u d d-C h i a r i s y n d r o m eb y t a r g e t i n gh y a l u r o n i ca c i ds y n t h a s e2(HA S 2)t op r o m o t ea u t o p h a g ya n di n h i b i ta n g i o g e n e s i s.T op r o v i d en e wc l u e sf o rt h es t u d yo ft h ee t i o l o g yo fB u d d-C h i a r i s y n d r o m e a n d t os e e kp o t e n t i a l t r e a t m e n t o p t i o n s.M e t h o d s T r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yw a su s e d t oo b s e r v et h en u m b e ro f a u t o p h a g o s o m e si nh u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a l c e l l s(HUV E C s).T h ea u t o p h a g ys t a i n i n gk i tw a su s e dt op e r f o r mf l u o r e s c e n c es t a i n i n g.MD Cm e t h o dw a su s e dt oo b s e r v e t h en u m b e ro fc e l l su n d e r g o i n ga u t o p h a g i cc e l ld e a t hu n d e raf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e.W e s t e r nb l o tw a su s e dt od e t e c t c h a n g e s i nt h ee x p r e s s i o no fp 6 2a n dL C 3,t w oa u t o p h a g i cm a r k e r s,i no r d e r t ov e r i f yt h a tm i R-3 1 3 3c o u l dp r o m o t ea u t o p h a g y.C C K-8a s s a yw a su s e dt ot e s tc e l lp r o l i f e r a t i o n,t u b ef o r m a t i o na s s a yw a su s e d t o t e s t t h e f o r m a t i o no f c a p i l l a r y-l i k e s t r u c t u r e sb y t h e c e l l s t ov e r i f y t h a tm i R-3 1 3 3c o u l d i n h i b i t a n g i o g e n e s i sb yp r o-m o t i n ga u t o p h a g y.m i R NAt a r g e tp r e d i c t i o ns o f t w a r em i R a n d aw a su s e dt op r e d i c td o w n s t r e a mg e n e st h a t c o u l db ep o t e n t i a l l yr e g u l a t e db ym i R-3 1 3 3,a n d t h e e x p r e s s i o no fHA S 2p r o t e i nw a sd e t e c t e db yW e s t e r nb l o t t i n ga f t e r t r a n s f e c t i o nw i t hm i R-3 1 3 3,c o n f i r m i n gt h a tm i R-3 1 3 3c o u l dn e g a t i v e l yr e g u l a t eHA S 2.M o r e o v e r,a f t e rk n o c k i n go u tHA S 2w i t hs i R NA,c h a n g e si nc e l lp r o l i f e r a t i o n,t u b e f o r m a t i o n,a n de x p r e s s i o no fa u t o p h a g ym a r k e r sw e r ed e t e c t e dt ov e r i f yt h a tm i R-3 1 3 3p r o m o t e sa u t o p h a g ya n di n h i b i t sa n g i o g e n e s i sb yt a r g e t i n gHA S 2.R e s u l t s T r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yr e s u l t ss h o w e dt h a tc e l l st r a n s f e c t e dw i t ht h em i R-3 1 3 3m i m i cg r o u ph a dm o r e a u t o p h a g o s o m e s t h a n t h e i r n e g a t i v e c o n t r o l s.F l u o r e s c e n c e s t a i n i n gw i t hMD Cm e t h o ds h o w e dt h a t t h em i m i cg r o u ph a dm o r eMD Cs t a i n i n gc o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p,w h i l et h ei n h i b i t o rg r o