miR-1298通过调控SetD7表达抑制青光眼视网膜神经节细胞生长.pdf

国际老年医学杂志 年 月第 卷第 期 ，国际老年医学杂志编辑部 河北省卫生厅科研基金项目（）通过调控 表达抑制青光眼视网膜神经节细胞生长谢九冰杨杉杉陈喜月岳向东唐山市眼科医院，唐山 摘要目的探索 调控青光眼视网膜神经节细胞生长及其机制。方法 只 小鼠被用于阻断巩膜上静脉建立慢性小鼠青光眼模型。脂多糖诱导 细胞作为体外模型，同时转染 （空白对照组）、重组人 组蛋白甲基转移酶（）。采用 实验、乳酸脱氢酶（）活性和 、试剂盒、和 方法探索 的功能和机制。结果在青光眼小鼠模型视网膜组织中 表达量显著提高。上调 能够抑制 细胞增殖和激活 活性，下调 能够促进 细胞增殖和减少 活性。是 调控靶点，激活 可以减弱 对青光眼视网膜神经节细胞生长的抑制作用。结论 在青光眼小鼠模型视网膜组织中表达量显著提高，能够通过调控 表达抑制青光眼视网膜神经节细胞生长，的表达可为青光眼预防和治疗提供参考。关键词 ；青光眼；重组人 组蛋白甲基转移酶；视网膜神经节细胞 ：，（），（），；青光眼多发于中老年人，因为这个时期的晶体处于膨胀期，容易造成浅前房，诱发青光眼发作，尤其是原发性青光眼好发于老年人，女性较男性更为多见 。青光眼特征是视网膜神经节细胞变性和视神经损伤，最终导致患者视野损失以及比较度和颜色敏感性减弱 。青光眼表现为视神经头的视野损失和功能性视力丧失及眼压升高 。目前，治疗青光眼的有效方法是降低眼压，但某些抗青光眼药物治疗会伴随眼部不良反应，包括干眼症、灼热感或刺痛感，这些症状往往无法改善，导致青光眼患者生活质量显著下降 。视网膜神经节细胞作为视觉信号的受体和保护者，在视觉信息从视网膜传递国际老年医学杂志 年 月第 卷第 期 ，谢九冰，等 通过调控 表达抑制青光眼视网膜神经节细胞生长到大脑视觉中枢中起着至关重要的作用。因此，有必要通过阐明视网膜神经节细胞增殖的调节机制和青光眼的病理变化来寻找治疗青光眼的新策略，这是青光眼治疗和视觉功能恢复的核心因素 。近年来发现，微小核糖核酸（，）参与了潜在的青光眼通路，包括局部黏连、紧密连接和转化生长因子（，）信号传导等 。一些 在青光眼相关通路中发挥重要作用，可作为青光眼发病机制的生物标志物 。（）在人小梁网细胞中的表达均显著降低，模拟物可显著抑制壳低聚糖诱导的细胞毒性、细胞凋亡，羰基化蛋白积累和细胞外基质（，）的增加，抑制剂可明显促进壳低聚糖对人小梁网细胞的增强作用 。是否对青光眼视网膜神经节细胞生长具有一定影响尚不清楚。重组人 组蛋白甲基转移酶（，）蛋白是 甲基转移酶 的调节器，负责维持细胞分裂过程中的 甲基化模式，在葡萄糖介导的炎症反应中起着关键作用，因此它是糖尿病血管并发症的候选基因，在糖尿病视网膜病变中发挥重要作用，而抑制 能够对抗核因子 （，）诱导的氧化应激和促炎症细胞因子的产生 。研究表明，多个抗氧化基因的上调和通过抑制 可提高反应活性氧（，）清除率，靶向 治疗 相关疾病具有潜在的价值 。本研究意在探索 调控青光眼视网膜神经节细胞生长及其可能的机制，为青光眼的预防和治疗提供参考。材料与方法 动物分组购买 级雄性 小鼠 只，月龄 周，体质量 。所有小鼠的外眼和眼底没有任何异常。实验前进行为期 周的适应性喂养，每笼 只，温度 ，光、暗循环 ，自由获取食物和水，有足够的活动空间。随后，将 只小鼠随机分为正常组和模型组，各 只。实验过程中严格遵守实验动物和使用指南，并符合相关伦理学规定。方法 青光眼小鼠造模采用阻断巩膜上静脉建立小鼠慢性青光眼模型。建立前腹腔注射 戊巴比妥钠（，）用于全身麻醉，其眼表面用戊巴比妥钠逐滴麻醉 次后开眼睑，使用精细剪剪开球结膜，暴露上直肌、下直肌，使用体视显微镜找到巩膜上静脉。用手术钳使上、远端静脉充血变白作为阻断成功的指标。于造模第 天处死两组小鼠，获取视网膜标本以检测 表达水平。从两组小鼠视网膜组织中获取视网膜细胞，处死小鼠后立即取出眼球，用无菌磷酸盐缓冲液（，）清洗去表面附着的血液和眼球表面的细胞。随后，将眼球在无菌条件下分离，取出视网膜组织。将视网膜组织放入含有 胰蛋白酶的无菌 中，下孵育 ，使其充分消化。分离视网膜细胞：消化结束后，用无菌 洗涤组织，将其在培养皿中加入含有 胎牛血清的完整无菌 ，用细胞筛过滤，去除残留的组织碎片，获得单个视网膜细胞。细胞转染与分组 细胞（人视网膜细胞株，中国科学院上海生命科学院细胞资源中心）加入 完全培养基（含 胎牛血清）中，的孵箱中培养。脂多糖加入 细胞（个细胞）诱导模型。细胞实验分组依次分为空白对照组、组、组，根据转染试剂说明书步骤，通过 瞬时转染，分别将 、转入 细胞，转染后 收集细胞，实时荧光定量 （，）检测转染效率后，用于后续实验。检测 在小鼠视网膜和细胞中的相对表达量根据说明书操作步骤，使用 试剂从各组小鼠视网膜细胞和 细胞分 离 总 ，分 别 通 过 和 试剂盒进行反转录和 ，反应条件：持续 ，循环 次，持续 ，循环 ，循环 ，并使用 和 作为内部参照，相对表达量采用 计算，引物见表 。表 引物序列基因引物序列 ：法检测细胞增殖细胞转染 后，国际老年医学杂志 年 月第 卷第 期 ，谢九冰，等 通过调控 表达抑制青光眼视网膜神经节细胞生长用 法检测细胞增殖，根据 试剂盒说明书进行，在 孔板每孔加入 ，孵育箱培养 后，加入 （）培养 ，离心 ，去上清，加入二甲基亚砜 ，振荡 。在 处使用分光光度读板器（，美国）测量吸光度值。乳酸脱氢酶（，）活性和 蛋白表达水平细胞转染 后，用放射免疫沉淀（，）裂解缓冲液提取蛋白，用 法测定蛋白质含量。活性试剂盒和 ，试剂盒用于检查 细胞 活性水平、和 蛋白表达量。检测 细胞淋巴瘤 白血病 基因（，）、相关蛋白基因（，）和 蛋白表达细胞蛋白提取及定量：取对数生长期的各组细胞，加入混有蛋白酶抑制剂的 裂解液，置于冰上裂解 ，以 离心 ，收集上清即为所提取蛋白，使用 蛋白质测定试剂盒测定样品的蛋白质浓度。检测：通过 分离样品中总蛋白质并印记到 膜上，用含有 脱脂奶粉的 清 洗 （，）封闭 ，采用相应的一抗（、稀释比例均为 ）过夜孵育，三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（，）洗膜 次，每次 ；辣根过氧化酶（，）标记的二抗孵育 ，洗膜 次，结合 化学发光法显影，图像软件进行分度值分析，以 为内参，蛋白相对表达 待测目标条带灰度值 内参条带灰度值。双荧光素酶报告实验检测 与 的相互作用关系首先使用在线网站 ：，：和 ：预测 和 的假定结合位点。并通过双荧光素酶活性测定进行验证，按照 建议培养 细胞，构建 和 质粒。将 细胞培养于 孔板中，根据制造商的说明书，的 和 使用 和 及阴性对照载体（空白质粒）分别转染 细胞。转染 后，使用荧光素酶测定试剂盒分析荧光素酶活性，用萤火虫荧光值和海肾荧光值的比值计算荧光素酶报告基因的活性。免疫荧光 细胞用磷酸盐吐温缓冲液（，）次，每次 ，用 （）驴血清在 孵育。然后，一抗（）在 下放置 。细胞用 洗 次，结合的二级抗体孵育（驴抗鼠 ；驴抗兔 ；美国）在室温下孵育 。细胞用 ，二脒基 苯基吲哚在室温下染色 。显微镜（，德国）观察细胞。统计学方法使用 统计学软件进行数据分析，正态分布计量资料采用珋 表示，通过配对 检验或单因素方差分析进行组间差异分析，为差异有统计学意义。结果 在小鼠青光眼视网膜组织中的表达 在青光眼模型组小鼠视网膜组织中的表达量（）高于正常组（），差异有统计学意 义（，）。在各 细胞组的表达水平及其 细胞增殖的影响体外细胞实验中，与空白对照组比较，转染能够上调 在 细胞中的表达量，下调 在 细胞中的表达量，差异均具有统计学意义（）。同时，上调 能够抑制 细胞增殖，激活 活性。下调 能够促进 细胞增殖，降低 活性。活性增强说明细胞死亡增加，以上结果说明 能够抑制 细胞增殖，见表 、表 。对 细胞 、和 的影响与空白对照组比较，在 组中 细胞中 、活性被上调，信号通路被激活；同时，在 组，细 胞 中 、活性减少，信号通路被抑制，见表 、表 、图 、图 。国际老年医学杂志 年 月第 卷第 期 ，谢九冰，等 通过调控 表达抑制青光眼视网膜神经节细胞生长表 上调 对 细胞中 表达、细胞增殖、活性的影响组别样本量 细胞增殖（值）活性（）空白对照组 组 值 值 表 下调 对 细胞中 表达、细胞增殖、活性的影响组别样本量 细胞增殖（值）活性（）空白对照组 组 值 值 表 对 、活性、的影响组别样本量 活性（）活性（）蛋白空白对照组 组 值 值 表 对 、活性、的影响组别样本量 活性（）活性（）空白对照组 组 值 值?图 对 蛋白表达的影响?图 对 蛋白表达的影响 靶向结合并调控 表达通过序列预测发现 和 端的 区域存在结合位点，见图 。荧光素酶报告基因实验结果显示，与 组相比，与 共转染后，检测到荧光素酶活性显著降低，差异有统计学意义（）；而与 共转染后，荧光素酶活性无明显变化（），见图 。过表达 可抑制 细胞的 表达量，蛋 白 表 达 在 组（）低于空白对照组（），差异有统 计 学 意 义（，）。国际老年医学杂志 年 月第 卷第 期 ，谢九冰，等 通过调控 表达抑制青光眼视网膜神经节细胞生长 蛋白表达在 组（）高于空白对照组（），差异有统计学意义（）。同时免疫荧光图显示 过表达抑制 细胞中 蛋白表达量，见图 。图 与 的结合位点?图 组、组与 、的荧光素酶相对活性表达 通过调控 表达抑制青光眼视网膜神经节细胞生长与空白对照组比较，质粒能够逆转 对 的抑制作用和 信号通路的激活作用。同时 恢复 对 细胞增殖，减少 、和 的活性，见图 、表 。?图 免疫荧光检测过表达 对 细胞中 蛋白表达的影响（）?图 检测各组中 、蛋白表达表 各组 蛋白、蛋白、细胞增殖、活性、活性、活性比较组别样本量 蛋白 细胞增殖（值）活性（）活性（）活性（）空白对照组 组 组 值 值 注：与空白对照组比较 ，与 组比较 讨论青光眼是一种进行性视神经病变，是致盲的主要原因 。因早期的开角型青光眼患者无不适感，易忽视，视神经出现损伤时，造成视野及视力下降，才被检查发现，青光眼的治疗主要是通过药理学或外科降低眼压 。青光眼根据不同的病因和预后可分为原发性先天性青光眼和继发性青光眼。小梁切除术和小梁切除术加上抗纤维化药物是最常见的治疗方法 。由于抗纤维化药物的使用存在较高的并发症风险 。因此，探索青光眼的发病机制、寻找青光眼治疗的新靶标成为研究热点之一。通过下调信使 的靶基因或抑制蛋白质翻译，在基因表达调控中发挥重要作用 。此外，在多种生理过程中也起着调节作国际老年医学杂志 年 月第 卷第 期 ，谢九冰，等 通过调控 表达抑制青光眼视网膜神经节细胞生长用，包括细胞增殖和凋亡等，从而在许多疾病的发病机制中发挥作用 。在青光眼的发生发展过程中具有调节作用，同时 也参与了青光眼相关基因的生物学过程 。研究表明，进行性视神经病变和青光眼患者的 表达发生变化，提示 可能是导致神经元细胞死亡的原因之一 。已有证据表明，一系列 与视网膜发育有关，如视网膜神经发生病变、视网膜内稳态和人类视觉系统的视网膜损伤等 。本研究发现 在小鼠青光眼视网膜组织中高表达，提示 可能与青光眼视网膜病变密切相关。通过体外细胞模型发现，在人视网膜细胞株 细胞中 质粒能够上调 在 细胞中的表达量，同时上调 能够抑制 细胞增殖和激活 活性，下调 能够下调 在 细胞中的表达量，下调 能够促进 细胞增殖和减少 活性，说明 能够促进细胞凋亡，抑制 细胞增殖，提示 可能是调控青光眼的重要基因，但是机制尚不清楚，需要继续研究。有研究表明 抑制剂可明显促进慢性氧化应激对人小梁网细胞的增强作用，是 的下游目标，能显著抑制慢性氧化应激诱导的人小梁网细胞 抑制剂的增加效应；慢 性 氧 化 应 激 中 和 的表达水平显著升高，和 角朊素明显降低，抑制剂可显著促进这种增加效应，可逆转慢性氧化应激作用下 的 作 用 。另 外 可 通 过 抑 制 通路和激活典型 通路，抑制慢性氧化应激诱导的细胞凋亡，保护 细胞免受慢性氧化应激损伤 。、和 为学术界公认的典型的凋亡信