CytochalasinH对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca%5E%282%2B%29_CaN_NFAT信号通路的影响.pdf

广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 43 卷第 4 期2023 年 7 月Vol.43 No.4Jul.2023邓小林，饶乐怡，徐静.Cytochalasin H对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca2+/CaN/NFAT信号通路的影响J.广东海洋大学学报,2023,43(4):19-26.收稿日期：2023-02-14基金项目：2022年度海南大学协同创新中心项目（XTCX2022STB01）；海南省重大科技项目（ZDKJ202008/ZDKJ202018）；海南省重点研发项目（ZDYF2021108）；国家自然科学基金（81973229/82160675）；广东省海洋药物重点实验室开放课题（LMM2021-4）第一作者：邓小林（1998），硕士研究生，研究方向为红树林微生物代谢产物的免疫抑制药理活性机制。E-mail:通信作者：徐静（1981），教授，研究方向为海南特有药用植物和红树林微生物天然产物化学以及药物先导化合物的开发。E-mail:Cytochalasin H对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca2+/CaN/NFAT信号通路的影响邓小林，饶乐怡，徐静(海南大学生态文明协同创新中心/海南大学化学工程与技术学院 海南省精细化工工程技术研究中心，海南 海口 570228)摘要：【目的】研究红树林植物大红树内生真菌Phomopsis asparagi DHS-48得到的次级代谢产物cytochalasin H对小鼠（Mus musculus）脾细胞的免疫抑制活性及其作用机制。【方法】用不同浓度（3、6、12、25、30 mol/L）cytochalasin H处理小鼠脾细胞，通过CCK-8活力测定法检测其对刀豆蛋白A（Concanavalin A，ConA）诱导小鼠脾细胞增殖的抑制作用；流式细胞术检测cytochalasin H对小鼠脾细胞凋亡的影响；免疫荧光实验检测cytochalasin H对细胞中NFAT入核及钙离子内流的影响；酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）和免疫蛋白印迹法（Western blotting）测定cytochalasin H对脾细胞中NFAT信号通路的影响。【结果】CCK-8实验表明，cytochalasin H对于正常小鼠脾淋巴细胞的毒性比环孢菌素（Cyclosporin A，Cs A）弱，半抑制浓度IC50=（35.07 1.16）mol/L；流式细胞术显示，cytochalasin H对ConA刺激的脾淋巴细胞无促凋亡作用；cytochalasin H对ConA诱导增殖的小鼠脾淋巴细胞具有显著的抑制效果，IC50=（14.810.81）mol/L，且呈剂量依赖性；免疫荧光结果表明，cytochalasin H在浓度为15 mol/L时显著地抑制了钙离子内流；Western Blotting结果显示cytochalasin H对脾淋巴细胞中CaN、NFAT蛋白（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）的表达具有显著的抑制作用；免疫荧光结果显示，cytochalasin H抑制细胞浆内的NFAT转移到细胞核；ELISA测试结果证明，cytochalasin H能显著抑制下游细胞因子白介素-2（IL-2）的分泌（=0.05）。【结论】Cytochalasin H通过抑制Ca2+/CaN/NFAT信号通路转导显著抑制T细胞增殖和活化。关键词：cytochalasin H；T细胞增殖；细胞凋亡；Ca2+/CaN/NFAT信号通路；免疫抑制剂中图分类号：R967文献标志码：A文章编号：1673-9159（2023）04-0019-08doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2023.04.003Inhibitory Effect of Cytochalasin H on the Proliferation of Mouse SpleenCells and Its Effects on Ca2+/CaN/NFAT Signaling PathwayDENG Xiao-lin,RAO Le-yi,XU Jing(Collaborative Innovation Center of Ecological Civilization,Hainan University/Hainan Provincial FineChemical Engineering Research Center,College of Chemical Engineering and Technology,HainanUniversity,Haikou 570228,China)第43卷广东海洋大学学报Abstract:【Objective】To study the immunosuppressive activity and mechanism of the secondarymetabolite cytochalasin H obtained from the endophytic fungus Phomopsis asparagi DHS-48 of themangrove plant Rhizophora mangle on mouse splenocytes.【Method】Mouse splenocytes weretreated with different concentrations of cytochalasin H(3,6,12,25,30 mol/L),and its inhibitoryeffect on Concanavalin A(ConA)-induced proliferation of mouse splenocytes was detected by CCK-8assay.The effect of cytochalasin H on the apoptosis of mouse splenocytes was detected by flowcytometry.The effect of cytochalasin H on the nuclear entry of NFAT and the influx of calcium ions incells was detected by immunofluorescence experiment.Enzyme-linked immune sorbent assay(ELISA)and western blotting were used to determine the effect of cytochalasin H on NFAT signaling pathway insplenocytes.【Result】CCK-8 assay showed that cytochalasin H had a small toxic effect onlymphocytes,compared with Cyclosporin A(Cs A)(half maximal inhibitory concentration IC50=35.07 1.16 mol/L).Flow cytometry showed that cytochalasin H did not promote apoptosis of spleenlymphocytes stimulated by ConA.Cell proliferation assays showed that cytochalasin H inhibited theproliferation of ConA-induced T murine splenic lymphocyte(IC50=14.81 0.81 mol/L)in a dose-dependent manner.Immunofluorescence showed that cytochalasin H significantly inhibited calciuminflux at the concentration of 15 mol/L.Western Blotting showed that cytochalasin H significantlyinhibited the expression of nuclear factor of activated T-cells(NFAT)in spleen lymphocytes.Immunofluorescence showed that cytochalasin H inhibited the transfer of NFAT from cytoplasm tonucleus.ELISA showed that cytochalasin H decreased the secretion of the downstream cytokineinterleukin-2(IL-2)(=0.05).【Conclusion】Cytochalasin H significantly inhibits T cell proliferationby inhibiting Ca2+/CaN/NFAT signaling pathway transduction.Key words:cytochalasin H;T cell proliferation;cell apoptosis;Ca2+/CaN/NFAT signaling pathway;immunosuppressant免疫抑制药物是指对机体的免疫反应具有抑制作用的药物，能够抑制机体发生的异常的免疫反应，临床上广泛应用于引起超敏反应性疾病、器官移植手术后的抗排斥反应以及自身免疫性疾病的治疗1-4。常用的免疫抑制药物主要有环孢菌素 A（Cs A）、他克莫司（FK506）、雷帕霉素（Rapamycin）、霉酚酸脂（Mycophenolate mofetil）等，但由于上述免疫抑制剂和其他免疫抑制剂（如糖皮质激素等）具有严重的毒性，影响肾脏、神经和胃肠道系统，且很多临床上使用的免疫抑制剂的有效剂量与中毒剂量非常接近，因此开发安全有效的新型免疫抑制药物是急需的5-7。T淋巴细胞在免疫应答中起着关键作用，当其受刺激激活后，引发细胞内Ca2+浓度的改变，导致免疫细胞功能紊乱，如能够促进细胞内的转录因子从细胞质向细胞核易位，其中最典型的例子就是Ca2+/CaN/NFAT（钙离子/钙调蛋白磷酸酶/活化T细胞核因子）信号通路，当胞内Ca2+浓度增加，CaN被活化，导致NFAT去磷酸化并发生核易位，从而发挥T淋巴细胞免疫应答功能8-10。红树林内生真菌可产生许多结构独特和生物活性多样的次生代谢物，被认为是最关键和最有前途的生物活性天然产物来源之一11-12。超过50%的红树林内生真菌生物活性次生代谢物是由曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）真菌产生的，其中拟盘多毛孢属（Pestalotiopsi）、链格孢属（Alternaria）和拟茎点霉属（Phomopsis）是主要的次级代谢物生产者13。拟茎点霉属（Phomopsis）真菌具有 900 多个宿主，近年来引起了天然产物研究者的广泛关注14-15。从中分离出了多种生物活性代 谢 物 如 dicerandrols16、phomopchalasins B-C17、phompsichalasin18、cytochalasins J1-J3、cytochalasinsH1-H219和cytosporone U20等。本课题组从海南红树林大红树来源的内生真菌 Phomopsis asparagi DHS-48 中发现了化合物20第4期邓小林等：Cytochalasin H对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca2+/CaN/N