VEGF及其相关低氧因子在不同发育阶段牦牛肾脏中的表达分布研究.pdf

1542核农学报2 0 2 3,37(8)：1542 1550文章编号：10 0 0-8 551(2 0 2 3)0 8-1542-0 9Journal of Nuclear Agricultural SciencesVEGF及其相关低氧因子在不同发育阶段耗牛肾脏中的表达分布研究周焗琳1,2,3董仕慧1张伊阳71,2,3李睿1,2,3杨映雪！柴雅静1乔自林2.3杨琨1,2,3,*（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州7 30 0 30；西北民族大学生物医学研究中心甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃兰州730030；西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州730030）摘要：为探究血管内皮生长因子（VECF）、血管内皮生长因子受体（VECFR-2）、低氧诱导因子-1(HIF-1)和血管细胞粘附因子-1(VCAM-1)在耗牛肾脏发育过程中适应高原低氧环境的调控作用，本研究选取不同发育阶段（新生、9月龄、成年）的高原健康耗牛，采用H&E染色、免疫组织化学染色（IHC）以及实时荧光定量PCR（q RT-PCR）对不同发育阶段耗牛肾脏组织中VEGF、VEG FR-2、H I F-1和VCAM-1的表达分布进行分析。H&E结果显示，随着年龄的增长，肾小球和肾小管直径、肾小球和肾小管上皮细胞以及肾间质细胞面积逐渐增加。IHC结果显示，VEGF、VEG FR-2、H I F-1和VCAM-1主要分布在肾小管上皮细胞和肾小球细胞胞质，且表达量与年龄呈正相关。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示，VEGF和HIF-1在新生组的表达水平显著高于9月龄和成年组（P0.05）；VEG FR-2 在新生组和成年组的相对表达差异不显著；VCAM-1在新生和9月龄表达较高，二者间差异不显著。VEGF、VEGFR-2、H I F-1和VCAM-1表达量与年龄的相关性较强。综上，推测在低氧下VECF等因子上调促进血管生成、红细胞生成和糖酵解过程,与耗牛肾脏发育及适应高原低氧环境密切相关。本研究结果为进一步探究耗牛肾脏对高原低氧环境的适应性提供了基础资料。关键词：耗牛；肾脏发育；血管内皮生长因子（VECF)；血管内皮生长因子受体-2(VECFR-2)；低氧诱导因子-1(HIF-1)D0I:10.11869/j.issn.1000-8551.2023.08.1542耗牛（Bosgrunniens)是高原地区的特有牛种，具有耐低氧、低温和强紫外辐射的特点 。由于耗牛具有与低氧适应的解剖特征和生理特征的多种器官,如较大的心和肺、较厚的体表覆盖物和无功能的汗腺，使其能够适应高海拔低氧环境2-3。肾脏在诸多脏器中更易受到缺氧影响，这是由于缺氧条件下氧气在肾血管和动脉血管之间扩散分流，引起肾髓质的供氧量降低，同时肾小管耗氧量较高，从而无法维持正常生理功能4血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF）又称为血管通透因子（vascularpermeabilityfactor，VPF），是Senger等5 在肿瘤分泌物中发现的一种糖基化分泌性多肽因子，分子量约为34 45kDa，是一种生物活性强烈、结构高度保守的糖蛋白6 。有研究发现VEGF在肾脏组织中含量较高，主要由肾小球足细胞合成并在生理环境中通过旁分泌和自分泌发挥生理功能，如肾胚胎的生长发育、保护肾小球内皮细胞完整性和肾毛细血管的再生与修复(7 VECF的生物学功能是通过与内皮细胞中存在的特异性受体血管内皮生长因子受体-2（vascularendothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2）相结合来促进内皮细胞的增殖、提高血管通透性以及促进新血管生成，有研究表明VECF/VECFR-2与低氧引起的肾脏疾病密切相关8-9。VEGF是低氧诱导因子-l（h y p o x i a i n d u c i b l e f a c t o r-l，H IF-l）的下游靶基因，低氧状态中HIF-1与VEGF基因的5-端增收稿日期：2 0 2 2-10-0 9接受日期：2 0 2 2-12-2 7基金项目：国家自然科学基金项目（318 6 0 6 8 7），甘肃省自然科学基金（2 1JR11RA024），中央高校创新团队项目（3192 0 2 0 0 0 0 4）作者简介：周慢琳，女，主要从事临床兽医学研究。E-mail:*通讯作者：杨琨，男，副教授，主要从事高原动物适应性研究。E-mail:1543VECF及其相关低氧因子在不同发育阶段牛肾脏中的表达分布研究8期强子结合位点相互作用，调节VEGF的转录激活以及表达10-1。缺氧过程中，肾脏中VECF与HIF-1的mRNA同步变化，上调HIF-1mRNA可激活VEGF基因转录，促进血管重塑，便于将血液运送至肾小管的缺氧区域，减少肾损伤12 。有研究表明，VEGF可通过细胞外信号调节激酶1/2（extracellularsignal-regulatedkinase，ERK 1/2）和激活转录因子-2（a c t i v a t i n g t r a n s c r i p t i o n f a c t o r，A T F-2）的磷酸化特异性刺激血管细胞粘附因子-1(vascular cell adhesionmole-1，V C A M-1)的表达,可介导细胞间或细胞与基质间的接触与结合，进而促进细胞黏附和增殖，并与缺氧引起血管的重塑密切相关13-14(图1)。PI3K/AIt信号通路PI3K/Alt signalingpathway低氧Hypoxia血管生成VEGFR-2Angiogenesis+HIF-1VEGF十细胞生长VCAM-1Cell growthATF-2信号通路ATF-2 signaling促进表达pathwayPromoteExpression图1VEGF及其相关低氧因子相互关系示意图Fig.1Correlation diagram of VEGF and its related hypoxic factors目前对肾脏的研究主要集中在成年动物肾脏的结构特征,如大鼠、小鼠和狗等15;对不同年龄段肾脏的研究主要集中在小鼠和大鼠16-17 ;关于VECF等因子在耗牛肾脏发育过程中的高原低氧适应性仍鲜见报道。因此，本试验通过伊红-苏木精(（hematoxylin-eosin，H&E）染色、免疫组织化学染色（immunohistochemicalstaining，IH C）和实时荧光定量PCR（q u a n t i t a t i v e r e a l-timePCR，q RT-PCR)方法检测不同发育阶段耗牛肾脏VEGF及其受体VEGFR-2、H I F-1和VCAM-1的表达分布差异，结合VEGF的生物学功能推测其与耗牛高原低氧适应的关系，以期为进一步探究耗牛肾脏对高原低氧环境的适应性提供基础资料。1材料与方法1.1试验动物及样品研究对象为15头高原耗牛，均采集自甘肃省甘南藏族自治州某屠宰场。将15头临床表现正常的耗牛分为三个年龄组：新生耗牛（1 7 d,n=5）、9月龄耗牛(9月，n=5)和成年耗牛（6 岁，n=5）。所有组均包括雄性和雌性。在耗牛放血后15min内立即采集肾脏组织并用4%的多聚甲醛固定。1.2试验试剂磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、0.01molL-柠檬酸钠缓冲盐、伊红、苏木精、HistostatimPlus试剂盒（SP-0023）、抗VECF多克隆抗体（BS-1665R）、抗VEGFR-2多克隆抗体（BS-0565R）、抗HIF-1多克隆抗体（BS-20398R）、抗VCAM-1多克隆抗体（BS-8994R），北京博奥森生物技术有限公司；抗体结合用二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB)底物试剂盒（DA1010）,北京索莱宝科技有限公司；反转录试剂盒（AG11711），湖南艾科瑞生物工程有限公司。1.3H&E染色检测及指标测定1.3.1H&E染色将耗牛肾脏组织切成体积为1cm的小块后按照石蜡包埋的常规方法进行包埋,再对包埋好的蜡块进行修块和切片（厚度为5m），用于后续处理。使用H&E染色方法观察样本的组织学特征。1.3.2指标测定阝随机选取不同发育阶段耗牛肾脏组织切片各5张，在40 0 倍视野下随机选取5个不同区域拍摄，用ImageJ软件观察并测量不同发育阶段耗牛154437卷报核农学肾脏皮质中肾小球和肾小管直径及肾小球和肾小管上皮细胞、肾间质细胞面积1.4免疫组化检测使用HistostatimPlus试剂盒进行免疫组化染色，用于研究VECF、VEG FR-2、H I F-1和VCAM-1的表达水平，肾组织切片在二甲苯中脱蜡，并通过梯度酒精水化。经PBS冲洗后，放人0.0 1molL-柠檬酸钠缓冲液（pH值6.0)对切片进行高压灭菌（在微波炉中15min）,以回收抗原。内源性过氧化物酶在37 下用3%H,0,灭活10 min。然后用抗VEGF多克隆抗体、抗VEGFR-2多克隆抗体、抗HIF-1多克隆抗体和抗VCAM-1多克隆抗体（1:2 0 0 稀释度）在湿润的4室内过夜培养。抗体结合用DAB底物试剂盒染色，用苏木精对细胞核进行复染。对照组使用牛血清蛋白作为一抗，其他步骤和条件保持不变1.5QRT-PCR检测肾组织内VEGF、VEG FR-2、HIF-1和VCAM-1表达1.5.1引物的设计与合成根据GenBank中的VEGF、VEG FR-2、H I F-1和VCAM-1基因序列，采用PrimerPremier6.0设计VEGF、VEG FR-2、H I F-1和VCAM-1基因引物，同时以ACTB基因为内参基因,引物序列信息见表1，送至湖南艾科瑞生物工程有限公司合成。表1引物序列信息Table1Primersequenceinformation引物引物序列（53）产物长度PrimerPrimersequence(5-3)Product size/bpVEGFF:CTGCTGTGGACTTGAGTTGGG107R:GCTCCCGTAAGACGGATAAAAVEGFR-2F:GCCTTGCTGCTCTACCTTCACC249R:GGGCACACTCCAGACTTTCGHIF-1F:GGCGCGAACGACAAGAAAAA121R:GTGGCAACTGATGAGCAAGCVCAM-1F:CCACGGATTCTCTCGACCAAGA227R:TCGCCAACCTGAGCAGCAATACTBF:TCATCACCATCGGCAATGAG157R:AGCACCGTGTTGGCGTAGAG注：F：上游引物；R：下游引物。Note:F:Forward primer.R:Reverse primer.1.5.2qRT-PCR检测肾组织内VECF、VEG FR-2、HIF-1和VCAM-1表达按照反转录试剂盒说明书提取总RNA并将其反转成cDNA后进行qRT-PCR。反应总体系为2 0 L:H,08.2L,正反引物各0.4L,2Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 10 L,cDNA 1 L。反应程序：95预变性30 s，95变性5s，6 0 退火35s，40个循环。qRT-PCR反应在AppliedBiosystems7500荧光定量PCR仪（伯乐，上海）中进行，所得数值均用内参ACTB进行标准化。qRT-PCR结果采用2-AAC运算方法进行分析。1.6统计学分析通过光学显微镜（奥林巴斯，日本）观察并捕获染色组织切片图像，并通过图像分析软件ImageProPlus6.0进行定量检测VEGF、V EC FR-2、H I F-1和VCAM-1阳性表达结果。使用GraphPadPrism8.0进行统计分析，P0.05为差异显著。2结果与分析2.1H&E染色结果观察H&E染色结果可知，不同发育阶段牛肾脏的结构组织完整，发育状况良好，无