Hg%5E%282%2B%29介导的碳量子点荧光关-开法检测同型半胱氨酸.pdf

科研开发化工科技,():S C I E N C E&T E CHNO L OG YI NCHEM I C A LI N D U S T R Y基金项目:陕西省大学生创新创业训练计划项目(S );陕西省科学技术厅自然科学基础研究计划项目(J Q );西安医学院大学生创新创业训练计划项目().通讯联系人:张博(),男,陕西西安人,西安医学院副教授,主要从事新剂型及药物分析方法的研究工作.作者简介:吴易雨格(),女,新疆伊宁人,西安医学院在读学士,研究方向为碳量子制备及应用.收稿日期:H g介导的碳量子点荧光关开法检测同型半胱氨酸吴易雨格,龚凌益,陈盈盈,彭灿,王晨,贺茂芳,秦蓓,张博,(西安医学院 药学院,陕西 西安 ;西安医学院 药物研究所,陕西 西安 )摘要:以柠檬酸为碳源、乙二胺为氮源,采用一步水热法合成氮掺杂的荧光碳量子点.通过选择性实验发现H g可诱导碳量子点荧光猝灭(o f f),而同型半胱氨酸分子中的巯基,对于H g具有更强的配位能力,竞争性结合使H g由碳量子点表面解离,进而导致荧光恢复(o n),基于H g介导的关开机理建立了测定同型半胱氨酸的新方法.实验表明,c(同型半胱氨酸)m o l/L,碳量子点的荧光恢复程度与同型半胱氨酸浓度呈现良好的线性关系,线性方程为y x ,相关系数为r ,检测限为 m o l/L.该方法具有高选择性、高灵敏度,有望用于同型半胱氨酸的检测.关键词:碳量子点;H g;同型半胱氨酸;柠檬酸;乙二胺中图分类号:O 文献标识码:A文章编号:()同型半胱氨酸(h o m o c y s t e i n e,H c y)在体内不能合成,由进食含硫基氨基酸的蛋白质在体内代谢生成.致病机理主要包括损伤血管内皮细胞、促进血管平滑肌细胞增殖、影响凝血系统及脂质代谢,高同型半胱氨酸血症(高于 mm o l/L,HH c y)可 导 致 心 脑 血 管、神 经 系 统 等 多 种 疾病 .目前,同型半胱氨酸最主要的种检测方法为高效液相(H P L C)法和荧光偏振免疫检测(F P L A)法 ,但这些方法操作繁琐、仪器昂贵、需要专业的操作者等因素难以推广使用.因此,开发一种操作便捷、低成本且具有高选择性、高灵敏度的H c y检测方法尤为重要.荧 光 碳 量 子 点(c a r b o n q u a n t u m d o t s,C Q D s)是继富勒烯、碳纳米管及石墨烯之后最热门的碳纳米材料之一.这种纳米材料可应用于潜指纹的增强成像,强灵敏的荧光响应可用于检测环境污染物,与传统半导体量子点相比,具有良好的生物相容性、无毒、环境友好等特点,在 细 胞 内 可 用 于F e、C u等 的 微 量 检测 .研究以柠檬酸为碳源、乙二胺为氮源,采用一 步 水 热 法 合 成 氮 掺 杂 碳 量 子 点,构 建C Q D s H g猝 灭体系,以H g介导建 立关开法,可高效地控制碳量子点荧光的猝灭与恢复,为同型半胱氨酸的检测提供了新思路.实验部分试剂与仪器柠檬酸:天津市天力化学试剂有限公司;同型半胱氨酸:上海源叶生物科技有限公司;乙二胺、七水合硫酸亚铁(F e S O HO)、五水合硫酸铜(C u S O HO):上海市国药集团化学试剂有限公司;硝酸铬、硝酸铅、氯化锌:天津市河东区红岩试剂厂;无水氯化钙:天津市科密欧化学试剂有限公司;三氯化铁:上海麦克林生化科技有限公司;甲醇:天津益力化学试剂有限公司;氯化汞:贵州省铜仁化工研究所;以上试剂均为分析纯;去离子水:实验室自制;透析袋:D a,西安优博生物科技有限公司.荧光分光光度计:F ,日本株式会社日立高新技术科学那珂事业所;紫外可见分光光度计:C a r y ,美国安捷伦科技有限公司;傅里叶变换红外光谱仪:T E N S O R ,德国布鲁克公司;鼓风干燥箱:DHG A,真空干燥箱:D Z F ,上海一恒科学仪器有限公司;冷冻干燥机:L A B C ,上海甄明科学仪器有限公司;电子天平:S Q P,赛多利斯科学仪器北京有限公司.实验方法荧光碳量子点的合成参考文献 的合成方法,修订了纯化方法.称取柠檬酸约g溶于 m L的去离子水中,加入m L乙二胺,搅拌超声溶解,充分混匀后转移至 m L聚四氟乙烯反应釜,拧紧密封,置于鼓风干燥箱中 反应h.反应结束后,烘箱温度自然冷却至低于,取出深棕色的制备液装入 D a透析袋中,外透析液采用去离子水,间隔 m i n更换,透析约h,得到黄色澄清碳量子点内透析液.内透析液平铺于培养皿中,液层厚度小于 mm,在冰箱中先冻冰,然后再真空冷冻干燥,即得碳量子点棕色粉末,于冰箱冷冻保存.构建C Q D s H g猝灭体系配制m g/m LC Q D s、mm o l/LH g和 mm o l/LH c y作为储备液,t保存备用.取 LC Q D s储备液至 m L容量瓶中,加去离子水稀释至质量浓度为g/m L;分别取m LH g、H c y储备液至 m L容量瓶中,加去离子水 稀 释 至 浓 度 为 m o l/L作 为 工作液.以 n m为激发波长(e x),n m为荧光波长(e m),激发和发射狭缝宽度均为n m.取m LC Q D s工作液,加入到荧光比色杯中,测定荧光强度F,再加入H g工作液 L,摇匀,静置 m i n,测定荧光强度Fq.依据FFFq计算荧光强度差值.荧光关开法检测H c y在荧光比色杯中加入C Q D s工作液m L,H g工作液 L,摇匀并静置 m i n,测定荧光强度Fq.再加入H c y工作液,混合均匀,在室温下静置 m i n,测定恢复的荧光强度Fr.依据FFrFq计算荧光强度差值.结果与讨论碳量子点的表征与光学性能量子 点 的 合 成 方 法 和 光 学 性 能 参 考 文 献 ,修订的纯化过程见.猝灭体系的筛选选择C u、F e、F e、Z n、H g、C r、C a、P b(其他离子与中H g的配制和检测条件一致)种金属离子,分别考察对C Q D s的猝灭行为,并研究加入H c y后的恢复效果.记录各离子加入后C Q D s的荧光强度,通过比较筛选出H g和F e猝灭效果最好,见图.制备C Q D s F e和C Q D s H g种猝灭体系,分别加入H c y L,按照(FrFq)/Fq计算恢复率,最终筛选出合适体系,见图图.图不同金属离子对C Q D s猝灭效果/n m图H c y对C Q D s F e体系的恢复/n m图H c y对C Q D s H g体系的恢复第期吴易雨格,等 H g介导的碳量子点荧光关开法检测同型半胱氨酸由图图可知,F e对C Q D s的荧光猝灭效果最好,其次是H g,但在后续的荧光恢复实验中,C Q D s F e体系恢复效率低,不能达到预期效果,因此将其淘汰.然而,C Q D s H g体系的恢复率可以达到,通过H g介导,利用荧光信号关与开的特点,从而实现对H c y的检测,因此,选择C Q D s H g体系.C Q D s H g体系优化在实验中发现,(碳量子点)较高时,荧光强度大,随着H g加入量逐渐增加,猝灭现象会越发明显,但是在H c y加入后恢复效果并不理想,推测在溶液中,碳量子点的微观分散颗粒数与H g的数目存在某种匹配性,在该条件下,加入H c y,才有利于荧光恢复.优化(碳量子点)通过稀释碳量子点储备液,选择荧光强度F 、附近种质量浓度(、g/m L)的碳量子溶液 m L,分别加入 LH g 工作液,摇匀,静置 m i n,充分反应后测定荧光强度Fq.依据(FFq)/F计算荧光猝灭率,考察(碳量子点)对猝灭率的影响,见图.(碳量子点)/(gm L)图H g对不同(碳量子点)的猝灭率考察由图可知,碳量子点荧光强度F ,猝灭率约为,F ,猝灭率约为,(碳量子点)进一步增大,F ,猝灭率没有提高,反而降低至约,说明(碳量子点)进一步增加,由于碳量子点的微观分散颗粒数更多,不利于H g对其猝灭.因此,选择F 的(碳量子点)g/m L作为工作液.优化V(H g)在荧光比色杯中加入C Q D s工作液m L,分别加入、L H g工作液,摇匀并静置 m i n,测定荧光强度Fq,分析不同V(H g)对碳量子点的猝灭率的影响,见图./n m图不同V(H g)对碳量子点的猝灭率考察由图可知,碳量子点溶液中加入H g后,荧光强度随着V(H g)的增加,开始下降,且猝灭 程 度 随V(H g)的 增 加 不 断 加 大.V(H g)L,猝灭率约为,继续加入H g,猝灭率无明显变化,荧光光谱基本重合.考虑到后续荧光强度恢复效率和线性范围,最佳体积为V(H g)L.荧光猝灭反应时间动力学将 L H g加入到m L碳量子点溶液中,室温下改变反应时间,考察其对荧光猝灭效果的影响,结果见图.猝灭反应时间/m i n图荧光猝灭动力学考察由图可知,随着时间的延长,荧光强度先下降后保持稳定,反应时间为 m i n,荧光强度基本不变达到动态平衡,因此后续研究选定猝灭时间为 m i n.化工科技第 卷荧光恢复反应时间动力学在 m L碳 量 子 点 溶 液 中 加 入 LH g,猝灭反应 m i n,然后将H c y L加入该猝灭体系中,改变反应时间,考察其对荧光恢复效果的影响,结果见图.荧光恢复时间/m i n图恢复荧光动力学考察由图可知,开始加入H c y,荧光迅速恢复,说明H c y能够很好地竞争性结合H g,使荧光信号得以恢复.由于体积和微粒分散性的变化,荧光强度有一定波动,但随着时间延长,反应时间为 m i n,荧光强度趋于平衡,最佳荧光恢复时间为 m i n.建立荧光关开方法精密移取C Q D s工作液m L,H g工作液 L,加入荧光比色杯,摇匀并静置 m i n,待猝灭完全后测定荧光强度Fq.再加入H c y工作液,使c(H c y)、m o l/L,混合均匀,在室温下静置 m i n,以 n m为激发波长,n m为荧光波长,测定恢复的荧光强度Fr.依据FFrFq计算荧光强度差值,结果见图.c(H c y)/(m o lL)图荧光恢复程度与不同c(H c y)的线性关系由图可知,c(H c y)m o l/L,碳量子点的荧光恢复程度与c(H c y)呈现良好的线性关系,线性回归方程为y x ,相关系数r ,检测限为 m o l/L.结论实验以乙二胺为氮源、柠檬酸为碳源,采用一步水热法合成氮掺杂碳量子点探针(C Q D s).该纳米材料在激发波长为 n m、荧光波长为 n m时具有很好的荧光强度,同时对H g表现出选择性的 荧 光 猝 灭 效 应,而H c y可 竞 争 性 结 合H g,使碳量子点的荧光得以恢复,以荧光强度恢复程度和同型半胱氨酸浓度为线性关系,建立H g介导的碳量子点荧光关开法测定同型半胱氨酸,该方法具有选择性好、灵敏度高的优点,可用于测定同型半胱氨酸.参考文献:王清涛,秦晓光同型半胱氨酸的检测和临床应用J中华检验医学杂志,():邓旭,贾得志血同型半胱氨酸检测的临床意义J检验医学与临床,():G R I NANR,E S C O L A G I LJC,J U L V EJ,e ta l E p i g e n e t i cr e g u l a t i o n b ym i c r o R NA s i n h y p e r h o m o c y s t e i n e m i a a c c e l e r a t e d a t h e r o s c l e r o s i sJ I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o fM o l e c u l a rS c i e n c e s,:李红伟,李焰生同型半胱氨酸与神经系统疾病的研究进展J临床神经病学杂志,():朱玉霞,李扬,葛进,等糖尿病血清同型半胱氨酸测定的临床意义J中国危重病急救学,():张晓燕,牛秀敏同型半胱氨酸与妊娠J中华妇产科杂志,():P I N Z ONRT,S ANYA S IRDLR,P R AMUD I