短期投喂石榴皮水提物对花鲈防控杀鱼爱德华氏菌感染的作用.pdf

第 38 卷第 3 期大大 连连 海海 洋洋 大大 学学 学学 报报Vol.38 No.32 0 2 3 年 6 月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYJune 2 0 2 3DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2022-241文章编号:2095-1388(2023)03-0397-09短期投喂石榴皮水提物对花鲈防控杀鱼爱德华氏菌感染的作用胡建美1,2,3,马壮1,王宝屯1,2,3,黄伟民1,冯娟2,苏友禄1(1.仲恺农业工程学院 动物科技学院,健康养殖创新研究院,广东 广州 510225;2.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东 广州 510300;3.上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306)摘要:为探究石榴皮(Punica granatum L.)对花鲈(Lateolabrax maculatus)防控杀鱼爱德华氏菌(Ed-wardsiella piscicida)感染的作用,采用石榴皮水提物拌饲(添加量为 4、8 g/kg)后连续投喂花鲈(体质量为 10.14 g2.53 g)7 d,分别在投喂 3、5、7 d 时,检测鱼体血清生理生化指标和免疫相关酶活性,以及脾脏、鳃和头肾组织中免疫相关基因表达量,并用杀鱼爱德华氏菌浸泡感染花鲈,探究石榴皮水提物在细菌侵染鱼体中的防控效果。结果表明:与对照组相比,投喂添加石榴皮水提物饲料的试验组花鲈,随投喂时间延长,血清中总胆固醇、谷丙转氨酶、谷胱甘肽还原酶、乳酸脱氢酶、总蛋白和高密度脂蛋白含量均显著升高(P0.05),投喂 3、5 d 时,血糖含量显著降低(P0.05),碱性磷酸酶(AKP)活性显著升高(P 0.05);脾脏中 LZM 基因和头肾 NK-lysin、LZM 基因表达量降低,其余免疫相关基因相对表达量均有所升高;投喂石榴皮水提物混合饲料 5 d 后,使用杀鱼爱德华氏菌浸泡感染花鲈,其存活率显著提高(P0.05),说明石榴皮水提物对花鲈的杀鱼爱德华氏菌感染具有良好的防控效果,其中 4、8 g/kg 石榴皮水提物添加组对花鲈的相对保护率分别为 50%和 47%。研究表明,投喂石榴皮水提物混合饲料在短期内可有效增强花鲈免疫力和抗杀鱼爱德华氏菌感染力,且显著提高花鲈在杀鱼爱德华氏菌浸泡感染后的存活率。关键词:石榴皮;花鲈;杀鱼爱德华氏菌;免疫力中图分类号:S 948 文献标志码:A 花鲈(Lateolabrax maculatus)是中国重要的水产养殖品种,其隶属于鲈形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)花鲈属(Lateolabrax)。花鲈对环境适应能力强,适合海水网箱、海淡水池塘及工厂化养殖1,据 2022 中国渔业统计年鉴2,2021 年其年产量超 19.9 万 t,其中,广东省珠海市花鲈生产量占全国总产量的一半以上。随着养殖规模和密度的不断提高,花鲈养殖过程中的病害问题愈发严重。流行病学调查显示,咸淡水养殖的花鲈病害种类多3,其中维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)和杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)是其养殖过程中的主要致病菌4-5。非特异性免疫在鱼类抵御病原微生物的侵染中发挥重要作用。目前,对花鲈养殖中病害防控的有效途径是提高鱼体自身免疫力,减少抗生素及化学药物的使用。水产养殖用药明白纸 2022 年 1、2 号 规定,多种抗生素不允许用于水产养殖过程,抗生素的禁用大大增加了生产中病害防治难度。中草药是中国传统的医学瑰宝,历史悠久,其活性成分主要包括多糖、生物碱、有机酸和挥发油等,能够促进机体新陈代谢、提高机体免疫力和抗病能力6。相较于抗生素和化学药物,中草药不易产生毒副作用,也不易诱导致病菌产生耐药性,且多数中草药价格低廉,因此,其适合在水产养殖中推广应用。石榴原产中亚地区,在中国种植范围广阔,主要分布在陕西、安徽、四川和云南等地。石榴皮(Punica granatum L.)中含有丰富的酚类和黄酮类活性成分,据 中华人民共和国药典7记载,其具有抗氧化、抗菌、止血和驱虫等功效。石榴皮 收稿日期:2022-08-07 基金项目:广东省教育厅重点科研项目(2019KZDXM043)作者简介:胡建美(1995),女,硕士研究生。E-mail:1091158373 通信作者:苏友禄(1981),男,博士,研究员。E-mail:youlusu 提取物具有多种体外抑制病原微生物的作用。罗非鱼(Oreochromis niloticus)源维氏气单胞菌的单方中草药体外抑菌试验结果显示,其对石榴皮高度敏感,抑菌圈平均直径为 17 cm8;马玉和等9测定了 五 倍 子(Rhus chinensis)、石 榴 皮、诃 子(Terminalia chebula)、黄芩(Scutellaria baicalensis)和乌梅(Prunus mume)在不同盐度下对迟缓爱德华氏 菌(Edwardsiella tarda)和 嗜 水 气 单 胞 菌(Aeromonas hydrophila)的体外抑菌效果,结果表明,不同盐度下 5 种中草药对这两种细菌均存在抑制作用9;柯文杰等10采用琼脂扩散法测定了25 种中草药对普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的体外抑菌活性,结果显示,石榴皮具有显著的抑菌作用,最小抑菌浓度(MIC)为 1 mg/mL。本课题组前期采用平板打孔法及试管二倍稀释法测定了 60 种中草药对花鲈源杀鱼爱德华氏菌的体外抑/杀菌作用,其中石榴皮效果最佳,MIC 为15.625 mg/mL11。然而,体内试验数据的缺失致使石榴皮在花鲈抗杀鱼爱德华菌感染中的作用无法明晰。本研究中,通过将石榴皮水提物添加到花鲈日常饲料中,探究短期内石榴皮水提物拌饲投喂对花鲈血清生理生化、免疫相关酶活、组织免疫相关基因表达量,以及对花鲈浸泡感染杀鱼爱德华氏菌后死亡率的影响,以期为养殖生产中使用石榴皮水提物增强鱼类免疫力及抗病力提供数据支撑,为石榴皮替代抗生素防控花鲈细菌病害提供科学参考。1 材料方法1.1 材料1.1.1菌株及试验动物致病性杀鱼爱德华氏菌(E.piscicida 18BJ136)由课题组从患病花鲈中分离保存。健康花鲈购于广东省珠海市斗门区粉洲村某养殖场,体质量为(10.14 2.53)g,体 长 为(9.070.72)cm,暂养 15 d 后开始试验。1.1.2试剂石榴皮购自广东省珠海市斗门区某药房;海水鱼配合饲料(0.8 号)购自珠海市德海生物科技有限公司;脑心浸出液肉汤(BHI)培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。1.2 方法1.2.1 石榴皮水提物的制备 将石榴皮在 60 下烘干后粉碎,称取 100 g 的石榴皮粉用纱布包裹,注入500 mL 纯水,浸泡2 h,武火煮沸后,文火熬制 30 min,用 4 层纱布过滤,重复过滤两次,收集滤液,将滤液在水浴锅内 95100 下常压蒸发浓缩至 100 mL,121 下灭菌 20 min,置于 4 下保存。得到终质量浓度为 1 000 mg/mL(相当于生药质量浓度 1 g/mL)的石榴皮水提物。1.2.2 石榴皮水提物拌饲投喂试验选取 360 尾健康花鲈,随机分为 3 组,每组 120 尾,分别暂养于 2 m3水池内,连续充气,水温为(311),每天换水 1 次,正式试验的前一天停止喂食。试验中花鲈的日投喂量为鱼体质量的 3%,每天早、晚各 1 次,连续投喂 7 d。其中,试验组 1 和试验组2 拌饲投喂石榴皮水提物,按每 kg 配合饲料中分别添加 4、8 mL 终质量浓度为 1 000 mg/mL 的石榴皮水提物,配制成 4、8 g/kg 的中草药试验饲料12;对照组投喂正常配合饲料。1.2.3 样品采集在石榴皮水提物拌饲投喂 3、5、7 d 后,从各组取 3 尾鱼,将花鲈牺牲后解剖取其头肾、脾脏和鳃组织,立刻将组织样品悬浮在RNA 保存液中,4 下保存过夜,之后转移到-20 中保存,用于免疫相关基因表达水平的测定。在石榴皮水提物拌饲投喂 3、5、7 d 后,从各组取 10 尾鱼,使用 1 mL 无菌注射器快速从尾部静脉抽血,血液在 4 下静置 12 h 后,以 6 000 r/min离心 10 min,取上清液于-80 超低温冰箱中保存,用于生理生化及免疫相关酶活的测定。1.2.4血清生理生化指标的检测将血清样品送至广东省新海医院检验科,采用日本日立全自动生化分析仪(HITACHI 7180)检测花鲈血清总胆固醇(TC)、谷丙转氨酶(ALT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、血糖(GLU)、乳酸脱氢酶(LDH)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)共 10 个指标。1.2.5血清中相关酶活力的检测使用酸性磷酸酶和碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定花鲈血清样品中酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性。1.2.6 脾脏、鳃和头肾组织中免疫相关基因表达的检测 采用荧光定量 PCR(qPCR)检测各组织中的免疫相关基因,包括抗菌肽基因(NK-lysin)、免疫球蛋白 M 基因(IgM)、免疫球蛋白 D 基因(IgD)和溶菌酶基因(LZM),以 18S rRNA13作为内参基因。在 NCBI 上下载相关免疫基因的cDNA序 列,使 用 在 线 引 物 设 计 网 站(Primer3Plus)设计的特异性引物见表 1。采用893大连海洋大学学报 第 38 卷TRIzol Reagent 提取组织 RNA,分别使用 TBE 电泳、NanoDrop 分光光度计确认 RNA 纯度和浓度。使用 5All-In-One RT MasterMix 试剂盒将 RNA 逆转录合成 cDNA,-80 超低温冰箱中保存。荧光定量 PCR 在 LightCycler 480 中进行,所有反应均设置 3 个重复。qPCR 反应体系(共 10 L):cDNA模板 1 L,上、下 游 引 物 各 0.5 L,SYBRTM Green PCR Master Mix 5 L,ddH2O 3 L。采用两步法扩增产物,PCR 反应条件:95 下预变性30 s,95 下变性 5 s,60 下退火 60 s,共进行40 个循环。在 6095 下进行溶解曲线分析,以确定每对引物的特异性。反应结束后,采用 2-Ct方法计算基因表达量,以空白对照组相应组织的表达量为基准,计算试验组各组织的相对表达量。表 1 qPCR 引物Tab.1 qPCR primers 基因gene引物序列(5-3)primer sequence(5-3)18S rRNAF:GGGTCCGAAGCGTTTACTR:TCACCTCTAGCGGCACAANK-lysinF:AAGCTGAAGTCCGTCTGCAAR:AGCTCCTCGACCAATTTACCAIgMF:TGACCTGTACAGCCTCTGGAR:GATGGTAAACCGGCCCTGAALZMF:TCCAAGTGGGAGTCGAGCTAR:AGCGGCTGTTGATCTGGAAGIgDF:GCCAGATCAACGTCTGACCAR:TGCAGGCTGTCTGATCCAAG1.2.7花鲈浸泡感染杀鱼爱德华氏菌将冻存的杀鱼爱德华氏菌接种于 BHI 液体培养基中,28 下以 180 r/min 摇 床 培 养 12 h 后,菌 原 液 以5 000 r/min 离心 5 min,收集沉淀,用无菌生理盐水洗涤 3 次后重悬细菌,制成菌悬液。用石榴皮水提物拌饲投喂 3、5、7 d 时,分别从各组取 30 尾花鲈进行浸泡感染试验,每组 30 尾花鲈再细分为 3 个平行,即每个平行用 10 尾花鲈进行浸泡感染,试验期间水温为(32.00.5)。在盛有 8 L 水的玻璃缸中进行浸泡感染试验,3 次浸泡攻毒试验水体中杀鱼爱德华氏菌浓度分别为5.24105、6.03105、5.67105 CFU/