冬春季大口黑鲈溃疡症病原分离鉴定及病理形态学观察.pdf

黄泊文,向菲,田子琦,等.冬春季大口黑鲈溃疡症病原分离鉴定及病理形态学观察 J.华南农业大学学报,2023,44(4):549-555.HUANGBowen,XIANGFei,TIANZiqi,etal.Pathogenisolation,identificationandpathomorphologicalobservationofulcerativesyndromeoflargemouthbassinwinterandspringJ.JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity,2023,44(4):549-555.冬春季大口黑鲈溃疡症病原分离鉴定及病理形态学观察黄泊文1，向菲1，田子琦1，耿毅1，欧阳萍1，黄小丽2，陈德芳2，阳涛3(1四川农业大学动物医学院,四川成都611130；2四川农业大学动物科技学院,四川成都611130；3通威股份有限公司动物保健研究所,四川成都610041)摘要:【目的】近年来，养殖大口黑鲈 Micropterus salmoides 在冬春季流行一种体表形成明显溃疡的疫病，本研究旨在明确其病因。【方法】从眉山东坡区和洪雅县采集病料，采用病原学、病理学和分子生物学相结合的方法对患病鱼进行研究。【结果】溃疡组织压片观察到大量直径 1030m、长丝状且分支较少的菌丝体；组织病理学上，肌纤坏死、溶解，炎性细胞浸润，病变组织中分布大量由上皮样细胞、纤维细胞及位于中央的菌丝体组成的霉菌性肉芽肿；六胺银染色(Periodicacid-silvermetheramine，PASM)发现，霉菌性肉芽肿中央的菌丝体呈黑色。病变肌肉组织基于侵入丝囊霉菌 Aphanomyces invadans ITS 基因的特异性 PCR 检测为阳性。以葡糖糖/蛋白胨(Glucoseandpeotone，GP)琼脂分离培养得到的霉菌纯培养物(BW1、BW3)在灭菌池塘水过夜培养 12h 后，形成原孢子囊，符合侵入丝囊霉菌属特征；两株分离霉菌 ITS 基因序列分析发现，其与侵入丝囊霉菌 ITS 基因的序列相似性分别为 99.64%与 99.46%，在系统发育树上与侵入丝囊霉菌聚类为一支。【结论】确定大口黑鲈冬春季溃疡病是侵入丝囊霉菌感染所致。关键词:大口黑鲈；流行性溃疡综合征；侵入丝囊霉菌；组织病理学；霉菌性肉芽肿中图分类号:S941.4文献标志码:A文章编号:1001-411X(2023)04-0549-07Pathogen isolation,identification and pathomorphological observation ofulcerative syndrome of largemouth bass in winter and springHUANGBowen1,XIANGFei1,TIANZiqi1,GENGYi1,OUYANGPing1,HUANGXiaoli2,CHENDefang2,YANGTao3(1CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China;2DepartmentofAquaculture,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China;3AnimalHealthResearchInstituteofTongweiCo.,Ltd.,Chengdu610041,China)Abstract:【Objective】Inrecentyears,outbreakofanepidemicdiseasewithsignificantulcersonthepond-farmedlargemouthbass(Micropterus salmoides)happeninwinterandspring.Thisstudyaimstoidentifytheunderlyingetiology.【Method】Toclarifyitsetiology,diseasefishsamplesfromDongpoandHongyaDistrict,Meishanwerecollectedandanalyzedusingpathogenesis,pathologyandmolecularbiologymethods.【Result】Alargenumberoflongfilamentousandless-branchedmyceliawith1030mdiameterwereobservedintheulceratedtissues.Pathologically,weobservednecrosisorlysedmusclefibers,inflammatorycellinfiltrationin收稿日期：20220801网络首发时间：2023052510:37:37首发网址：https:/ incubated in sterilized pond water.Prosporangium formation was observed in the culture after 12 hincubationperiod,whichwasconsistentwiththecharacteristicsofAphanomyces.BasedonITSgenesequencingof BW1 and BW3,their ITS genes were found to have 99.64%and 99.46%sequence similarities with A.invadans,andthetwostrainsclusteredwithA.invadansinthephylogenetictree.【Conclusion】TheulcerdiseaseoflargemouthbassinwinterandspringhasbeencausedbyA.invadans.Key words:Micropterus salmoides;Epizooticulcerativesyndrome;Aphanomyces invadans;Histopathology;Fungalgranulomas流行性溃疡综合征(Epizooticulcerativesyndrome,EUS)是由侵入丝囊霉菌 Aphanomycesinvadans 引起的一种季节性流行性疫病，最早于1971 年在日本养殖的香鱼中报道1，目前已在澳大利亚、美国、印度等全球多个国家被发现，已知可感染 160 多种鱼类2，被世界动物卫生组织(WorldOrganizationforAnimalHealth，WOAH)列为法定申报疫病，我国将其列为二类动物疫病。该病以体表红斑、鳞片掉落及皮肤坏死性溃疡为临床病变特征，组织学上肌纤维广泛坏死和霉菌性肉芽肿为特征1,3-4，主要流行于冬春两季，发病后死亡率最高可达 100%5-6，给鱼类健康造成严重威胁。常藕琴等72019 年证实在珠江三角洲养殖的杂交鳢溃疡病的病原为侵入丝囊霉菌，首次确认了流行性溃疡综合征对我国养殖鳢的危害，目前在我国鲜见其他养殖鱼类感染发病的报道。大口黑鲈 Micropterus salmoides，又称加州鲈，具有适应性强、生长快、易起捕、经济价值高等优点，2019 年被列为我国渔业主导养殖品种，在全国范围内推广 8，养殖面积与产量快速提升，2020 年全国产量已达 62 万 t，并有进一步发展的强劲势头。但随着大口黑鲈养殖的快速发展，出现了如鰤诺卡菌病、运动性气单胞菌病等细菌性疾病；车轮虫病、斜管虫病等寄生虫病和大口黑鲈病毒病、大口黑鲈肝脾肿大病等病毒性疾病9-10，制约大口黑鲈养殖业健康发展。近年来养殖大口黑鲈在冬春两季发生一种以全身多处溃疡为病变特征的疫病，给大口黑鲈养殖造成较为严重损失。本研究采集自然发病病例，采用病原学、病理学和分子生物学相结合的方法进行检测，以期明确大口黑鲈冬春季溃疡病的病因，为有效防控该病提供科学依据。1 材料与方法 1.1 病料来源2020 年 11 月与 2021 年 3 月分别从四川眉山东坡区和洪雅县两地养殖场各采集患病明显的6 尾大口黑鲈，体质量均值(540.375.9)g。1.2 病理剖检与组织压片观察按照常规方法进行病理剖检，观察外部与内脏器官的病理变化；取自然发病鱼溃疡灶，置于载玻片上，制做组织压片，置于显微镜下观察并记录。1.3 组织病理学观察及基于侵入丝囊霉菌ITS基因的特异性 PCR 检测取溃疡灶与正常交接处组织与各内脏脏器，用体积分数为 10%的福尔马林固定，按常规石蜡切片的制作方法制作切片，进行苏木精伊红染色(Hematoxylin-eosinstaining,HE)及基底膜六胺银(Periodicacid-silvermetheramine,PASM)染色，置于显微镜下观察并记录。用真菌 DNA 提取试剂盒(Omegabio-tek)提取患鱼病变肌肉组织 DNA，作为 PCR 反应的模板，参考 OIE 水产手册11侵入丝囊霉菌诊断规程，合成 ITS11、ITS23 引物，进行基于霉菌 ITS 基因的 PCR 检测，预期扩增目的条带550bp。PCR 扩增产物经 10g/L 琼脂糖凝胶电泳检测。1.4 侵入丝囊霉菌的分离培养与形态学观察真菌分离培养参照 OIE 水产手册11侵入丝囊霉菌诊断规程，取溃疡组织置于葡糖糖/蛋白胨(Glucoseandpeotone，GP)琼脂中，25 条件下培550华南农业大学学报(https:/ 20 条件下孵育。依次在 5 个含灭菌池塘水的培养皿中洗涤培养物后，于灭菌池塘水 20 过夜。约 12h 后，在倒置显微镜下观察。1.5 分离侵入丝囊霉菌ITS基因序列分析用真菌 DNA 提取试剂盒提取分离霉菌纯培养物 DNA，作为 PCR 反应的模板，使用“1.3”中引物序列及 PCR 程序扩增 ITS 部分基因，PCR 扩增产物经 10g/L 琼脂糖凝胶电泳检测后，目的条带切胶回收，采用 TA 克隆法，克隆至 pUCm-T 载体送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，ITS 基因测序结果同 GenBank数据库中的序列进行相似性比对分析，用 Mega11.0软件采用邻接法构建系统进化树。2 结果与分析 2.1 病理剖检及组织压片观察患病大口黑鲈体表有形态不规则、大小不等的红斑及明显的体表溃疡，皮肤肌肉坏死、溶解，出血呈灰白色或血红色(图 1A)，溃疡主要位于背部与体侧，但部分病鱼溃疡发生在尾鳍或头部，头部溃疡导致颅骨破损与穿孔(图 1B、1C)。鳃与内脏器官除肝色泽呈土黄色外，其他组织器官无明显的眼观病变。体表溃疡组织压片镜检，可见大量长杆形、丝状、分支较少的菌丝体在肌肉中分布(图 1D)。ABCD100 mA：体表溃疡与红斑；B：头部溃疡伴随颅骨破损；C：尾柄基部溃疡；D：溃疡压片组织中的菌丝体A:Ulcerationandredspotonthebodysurface;B:Headulcerwithskullbreakage;C:Ulcerationatthebaseofthetailfin;D:Myceliainthesquashingtissue图 1 自然感染大口黑鲈临床症状及压片观察Fig.1 Clinical symptoms of naturally infected Micropterus salmoides and squashing tissue observation 2.2 组织病理学及基于侵入丝囊霉菌ITS基因的特异性 PCR 检测镜下观察 HE 染色的溃疡组织病理切片，皮肤表皮坏死、脱落；骨骼肌广泛性变性、坏死，肌纤维横纹消失，肌浆凝固，均质红染，甚至断裂、溶解；肌间隙与坏死的肌纤维内大量炎症细胞浸润(图 2A)。特征性的病变是在病变的肌肉与皮肤真皮中分布有大量境界清晰的大小不等、圆形或椭圆形