大口黑鲈IRF3的分子特征及其免疫表达.pdf

广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 43 卷第 4 期2023 年 7 月Vol.43 No.4Jul.2023荆鹏华，赵飞，谭爱萍，等.大口黑鲈IRF3的分子特征及其免疫表达J.广东海洋大学学报,2023,43(4):76-83.收稿日期：2023-04-07基金项目：中国水产科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2022GH04，2021SJ-XT3，2020TD45）；广州市农业和社会发展科技专题（2023B03J1305）；佛山市南海区农业农村局政府采购项目（2967855）第一作者：荆鹏华（1997），女，硕士研究生，研究方向为水产动物病害与免疫防控。E-mail:通信作者：赵飞（1979），男，博士，副研究员，研究方向为水产动物病害与免疫防控。E-mail:大口黑鲈IRF3的分子特征及其免疫表达荆鹏华1,2，赵飞2，谭爱萍2，邓玉婷2，邵蓬1，朱雪晴2，赖迎迢2，巩华2，黄志斌2（1.天津农学院水产学院，天津 300392；2.中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫与绿色养殖重点实验室，广东 广州 510380）摘要：【目的】克隆大口黑鲈（Micropterus salmoides）干扰素调节因子 3（interferon regulatory factor 3，IRF3）基因，命名为MsIRF3，探究该基因在大口黑鲈先天性免疫防御中的重要作用。【方法】根据大口黑鲈基因组中IRF3基因序列设计引物，克隆 MsIRF3基因；用生物信息学方法分析 MsIRF3的结构特征和理化性质；用鰤诺卡氏菌（Nocardia seriolae）或维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）感染大口黑鲈，并用病原类似物脂多糖（LPS）、脂磷壁酸（LTA）和聚肌胞苷酸 Poly（I：C）刺激大口黑鲈头肾白细胞，采用荧光定量PCR方法检测MsIRF3基因表达量的动态变化。【结果】MsIRF3的ORF全长为1 404 bp，编码467个氨基酸。MsIRF3包含DNA结合结构域（DBD）、IRF关联结构域（IAD）及丝氨酸结构域（SRD）等 3 个典型结构域。同源性分析表明，MsIRF3 与斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）IRF3的亲缘性最近。qRT-PCR分析表明，MsIRF3在健康大口黑鲈各组织中广泛表达，在肠和鳃中表达量相对较高（P 0.05）。鰤诺卡氏菌或维氏气单胞菌感染后，MsIRF3在肝脏、头肾和脾中表达量均上调（P 8 mg/L，日投喂量为鱼体质量的1%3%，期间定期换水。1.2 菌株、载体和试剂鰤诺卡氏菌（Nocardia seriolae）和维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）由广东省中国水产科学研究院珠江水产研究所水产病害与免疫研究室从大口黑鲈分离、鉴定并保存。大肠埃希菌（Escherichia coli）DH5 感受态细胞、Premix Ex TaqTM、TaKaRa EX Taq、反转录试剂盒 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、DNA Marker和PCR扩增试剂、pMD18-T vector 均购自 TaKaRa 公司（大连）；RNA提取试剂盒 RNeasy Mini Kit 购自 QIAGEN 公司（德国）；胶回收试剂盒E.Z.N.AGel Extraction Kit和质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I购自OMEGA公司（美国）；1640培养基购自Gibico公司（美国）；胎牛血清和 Percoll 分离液购自 Thermo 公司（美国）；LTA、LPS 和 Poly(I:C)均购自 Sigma Aldrich 公司（美国）。所用引物（表1）由广州艾基生物技术有限公司合成。1.3 大口黑鲈脾组织总RNA提取及反转录参照 RNA 提取试剂盒 RNeasy Mini Kit说明书提取大口黑鲈脾组织的总RNA，采用微量分光光度计测定RNA的OD值和浓度。参照PrimeScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA，保存于冰箱（-20）。1.4 MsIRF3基因的扩增及序列测定从大口黑鲈的基因组网站（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Micropterus+salmoides）上获得IRF3基因的开放阅读框（ORF）序列。借助DNAMAN软件设计特异性引物（表1）用于MsIRF3基因 ORF的 PCR扩增。反应体系（25 L）：Ex TaqDNA聚合酶0.25 L、10Buffer 2.5 L、dNTPs 1 L、上下游引物各1 L、cDNA模板1 L、去RNA酶水18.25 L。反应程序：95 5 min；95,30 s,60 30 s,72 90 s,35个循环；72 7 min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，按照 E.Z.N.AGel Extraction Kit胶回收试剂盒说明书回收目的片段。将纯化的PCR产物连接到pMD18-T载体，得到重组质粒pMD18-MsIRF3，再经冰浴30 min，热激90 s，转化到大肠埃希菌 DH5，均匀涂布 LB 平板（含100 g/mL氨苄），培养16 h后挑取单克隆阳性菌，PCR 验证后送广州艾基生物技术有限公司测序。1.5 MsIRF3生物信息学分析用 NCBI（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov）中 的Blast 进行同源性比对和相似性分析；用 Clustal XVersion 2 和 Geneman 进行多序列比对；用 Signal P5.0 Server（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）和NetNglyc Server（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0）分别预测信号肽和蛋白的糖基化位点；用 PredictProtein（https:/predictprotein.org/）预测蛋白质结构域；采用软件MEGA5.0（1 000次重复）利用邻接法（Neighbor-joining,NJ）构建系统发育树。1.6 MsIRF3在健康组织中的表达随机选取健康大口黑鲈 5 尾，分别采集血液、脑、鳃、肝脏、脾、头肾、皮肤、肌肉、心脏、肠等10种组织，于液氮中速冻，转入-70 C冰箱保存备用。参照1.3方法提取各组织总RNA，反转录为cDNA，根据DNAman设计定量引物（表1），采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测MsIRF3在不同组织中的表达水平。qRT-PCR反应体系：TB GreenTMPremixExTaqTM（2）10 L，ROX Reference Dye（50）0.4 L，cDNA模板2 L，正向引物和反向引物各0.8 L，无RNA H2O 6 L。qRT-PCR 在 Applied Biosystems7500 Real-Time PCR System（美国）上进行，反应程序为95 C 30 s；95 C 5 s，60 C 20 s，72 C 20 s，共40 个循环。以-actin 基因为内参，每个样品重表1实验所用引物Table 1Primers used in the study引物PrimersMsIRF3-FMsIRF3-RMsIRF3-QFMsIRF3-QR-actin-QF-actin-QR序列Sequences(53)ATGTCTCATTCTAAACCACTGCTTCAGTACGTCTCCATCATCTCGGATGAACCCGGAGCACACACAATATTCTCAAACAAATCGGGGCCTCCCTGGAGAAGAGCTACGTCAGCGAGTTGTGCAGGATAA用途UtilizationsMsIRF3 克隆qRT-PCRqRT-PCR78第4期荆鹏华等：大口黑鲈IRF3的分子特征及其免疫表达复3次。1.7 两种病原菌感染后MsIRF3表达将大口黑鲈平均分为3组，包含2个感染组和1 个对照组，每组 40 尾。感染组腹腔注射 100 L1.0 107CFU/mL 鰤诺卡氏菌或维氏气单胞菌，对照组注射 100 L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.2 7.4）。在感染后6、12、24、48、72 h，从每组中分别取鱼5尾，迅速分离肝脏、脾和头肾组织，放入液氮中速冻，后转入-70 C冰箱保存。根据1.3方法提取各组织总 RNA，合成 cDNA，采用 qRT-PCR 法检测在两种病原菌感染后不同组织中的 MsIRF3 表达动态。1.8 病原类似物刺激头肾白细胞后MsIRF3表达随机挑选健康大口黑鲈，用体积分数75%乙醇消毒体表，在无菌条件下剖取头肾组织，用1640培养基（100 U/mL青霉素、100 g/mL链霉素和25 U/mL肝素钠）清洗2次，100 m尼龙滤网研磨过滤2次。将细胞悬液缓慢加入体积分数34%/51%的Percoll分离液中，以500 g离心35 min。收集分离液中间的白色细胞层，用1640培养基清洗2次，以250 g离心10 min。取细胞沉淀，加入1640完全培养基 150 g/L胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素）重悬，调节细胞浓度为1.0 106mL-1，将细胞悬液铺板于24孔板（1 mL/孔），于28、体积分数5%CO2条件下培养12 h。在3个刺激组中分别添加10 L质量浓度均为1 mg/mL的LPS、LTA、Poly（I:C)刺激头肾白细胞，对照组添加10 L PBS。分别于6、12、24、48 h收集细胞，提取RNA，合成cDNA，采用qRT-PCR法分析MsIRF3基因表达动态变化。1.9 统计分析按照2Ct法分析qRT-PCR数据。用SPSS 24.0软件对数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），数据以平均值 标准误表示，P 0.05时差异显著，P 0.01时差异极显著。2 结果与分析2.1 MsIRF3的克隆及分子特征MsIRF3（GenBank 登录号：XM_038735465.1）基因的ORF为1 404 bp，预测编码467个氨基酸，蛋白相对分子质量为51 800，等电点为4.74。在线软件分析显示，MsIRF3蛋白N端含有一段25个氨基酸的信号肽（第1 25氨基酸），在第326氨基酸处存在糖基化位点。该蛋白预测包含DNA结合结构域（DNA binding domain，DBD）（第 1 108 氨基酸）、IRF 关联结构域（IRF association domain,IAD）（第255 435氨基酸）和富含丝氨酸结构域（serine-richdomain,SRD）（第440 450氨基酸），其中DBD结构域包含5个色氨酸重复元件（第11、26、38、57、73氨基酸）（图1）。氨基酸同源性比对（图 1）分析显示，MsIRF3与 斜 带 石 斑 鱼（Epinephelus coioides）IRF3 蛋 白（83.76%）同源性最高，其次是大黄鱼（Larimichthyscrocea）IRF3（81.80%）和棘头梅童鱼（Collichthyslucidus）IRF3（81.58%），说明IRF3在鱼类进化中相对保守。系统进化树（图2）显示，MsIRF3与石斑鱼IRF3的亲缘关系最近，且与鱼类IRF3聚为一簇，其他物种聚为一簇，形成鱼类、爬行类、哺乳类与鸟类对应分支。2.2 MsIRF3在健康组织中的分布图 3显示，MsIIRF3在健康大口黑鲈各组织中均有表达，且在不同组织中差异较大。MsIRF3在肠和鳃中表达量最高，且明显高于其他组织（P 0.05），其次是肝