大白菜叶色深绿突变体 dg 的转录组差异表达调控分析.pdf

第 46 卷第 4 期2023 年 7 月河 北 农 业 大 学 学 报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.46 No.4Jul.2 0 2 3大白菜叶色深绿突变体 dg 的转录组差异表达调控分析苏湘杰，岳晓楠，卢 银，解紫薇，王彦华，赵建军，刘梦洋（华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室/河北省绿色高效蔬菜产业协同创新中心/河北农业大学 园艺学院，保定 071001）摘要：大白菜以叶片作为主要食用器官，叶片深绿色可促进光合作用，有效提高作物产量和品质，叶片深绿色大白菜具有重要的应用和育种价值。本研究以大白菜叶色浅绿野生型 WT 和叶色深绿突变体 dg 为材料，通过高分辨率光谱明确突变体 dg 的叶色深绿表型，利用转录组测序（RNA-seq）分析转录水平上的表达调控网络，结果发现叶色深绿突变体 dg 中多个参与植物代谢过程和抗逆生理的细胞色素 P450 单加氧酶基因显著差异表达，同时影响卟啉与叶绿素代谢通路中 PPOX，NYC1-1，NYC1-2 和光合作用通路中 PetH，psbY 等光合相关基因的表达，对植物光合系统研究提供了重要材料，为 BrFC2 基因功能的全面揭示和研究奠定了前期基础。关 键 词：大白菜；叶色深绿；转录组测序中图分类号：S634.1开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文献标志码：ADifferential expression regulation analysis of dark-green leaf mutant dg in Chinese cabbageSUXiangjie,YUEXiaonan,LUYin,XIEZiwei,WANGYanhua,ZHAOJianjun,LIUMengyang（State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/Key Laboratory for Vegetable Germplasm Enhancement and Utilization of Hebei/Green and Efficient Vegetable Industry Collaborative Innovation Center in Hebei/College of Horticulture,Hebei Agricultural University,Baoding 071001,China）Abstract:The leaves of Chinese cabbage are the main edible organs.The dark green leaves can promote photosynthesis and effectively improve crop yield and quality.The research of dark green leaves in Chinese cabbage has important application and breeding value.In this study,the light-green leaf of wild type WT plants and the dark-green leaf of dg mutant were compared by high resolution spectrum to verify the dark-green leaf phenotype of the mutant Chinese cabbage.The transcriptional regulatory network was then analyzed using the RNA-seq data.The results showed that cytochrome P450 genes that are involved in metabolic processes and plant stress-resistant physiology were significantly differentially expressed in mutant dg.At the same time,the expression of photosynthesis-related genes were affected including PPOX,NYC1-1,NYC1-2 in porphyrin and chlorophyll metabolism pathway and PetH,psbY in photosynthesis pathway,which provided important materials for the study of plant photosynthetic system and laid a foundation for the comprehensive revelation and study of BrFC2 gene function.Keywords:Chinese cabbage;dark green leaf;RNA-Seq收稿日期：2023-03-10基金项目：河北省自然科学基金优秀青年科学基金项目（C2022204063）；河北省引进留学人员资助项目（C20220364）；河北省研究生创新资助项目（CXZZBS2021039）；河北农业大学引进人才项目（YJ201955）.第一作者：苏湘杰（1995），女，河北衡水人，博士研究生，研究方向为蔬菜种质资源评价及利用创新.E-mail：通信作者：刘梦洋（1989），女，河北保定人，副教授，研究方向为蔬菜功能基因组学.E-mail：liumengyang_ 赵建军（1971），男，河北沧州人，教授，博士生导师，研究方向为蔬菜功能基因组学.E-mail：本刊网址：http:/文章编号：1000-1573(2023)04-0022-11DOI：10.13320/ki.jauh.2023.005523第 4 期野生型 WT 和叶色深绿突变体 dg 为材料，对其进行转录组(RNA-Seq)测序，结合叶绿素合成通路的中间产物的含量变化，分析 BrFC2 突变后卟啉与叶绿素代谢途径和光合作用通路的差异表达基因，在转录水平上解析 BrFC2 调控网络。1 材料与方法1.1 试验材料在人工气候室分别播种大白菜叶色浅绿野生型WT 和叶色深绿突变体 dg 各 20 株。在苗期（播种后 45 d），选取长势一致的野生型 WT 和突变体 dg各 3 个生物学重复，采集由内向外数第 5 片真叶，液氮速冻，-80 保存备用。1.2 试验方法1.2.1 多光谱参数、叶绿素含量及叶绿素荧光参数测定 选取长势一致的大白菜叶色浅绿野生型 WT和叶色深绿突变体 dg 各 3 个生物学重复，采集由内向外数第 5 片新鲜叶片。使用高分辨率多光谱表型成像系统（丹麦 Videometer）采集大白菜叶片可见光图像及多光谱数据。叶绿素的提取和测定如 Porra等所述13。使用 Plant Explorer Pro 对苗期大白菜叶色浅绿野生型 WT 和叶色深绿突变体 dg 进行叶绿素荧光分析，计算光合作用参数，包括 PSII 的最大量子产率（Fv/Fm）、PSII 的有效量子产率 Y（II）、非光化学猝灭（NPQ）、调节能量耗散的量子产率（YNPQ）、调节能量耗散的非量子产率（Y-NO）和电子传输速率（ETR）。1.2.2 叶绿素合成通路中间物质测定 选取长势一致的大白菜叶色浅绿野生型 WT 和叶色深绿突变体dg 各 5 个生物学重复，快速称取 0.1 g，加入 0.9 mL PBS 溶液冰浴匀浆，4 放置 10 min，12 000 r/min，4 离心 5 min 后，加入预先包被-氨基酮戊酸（ALA）、粪卟啉原（CoprogenIII）、原卟啉IX（Proto）、原叶绿素酸酯（Pchlide）、叶绿素酸酯（Chlide）、血红素（Heme）、叶绿素 a（Chlorophyll a）和叶绿素 b（Chlorophyll b）抗体的包被微孔中，反应后，用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度（OD 值）。绘制各物质的标准曲线，计算测量前体物质的含量。1.2.3 RNA 提取及转录组测序使用 Eastep Super总 RNA 提取试剂盒（Promega）提取植物总 RNA，NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina大白菜（Brassica rapa L.ssp.pekinensis）属十字花科芸薹属 2 年生蔬菜作物，广泛栽培于我国北部地区，在日常生活中占有重要地位。大白菜叶片作为主要食用部位，颜色种类较多，差异较大。近年来，叶片深绿色大白菜更容易受到消费者的青睐，叶色深绿可促进光合作用，有效提高产量和品质，具有重要的应用价值，也是研究光合系统结构和基因调控机制的理想材料。叶片颜色突变是植物最常见的且易于鉴定的突变表型。近年，科学家们已鉴定出大量的叶绿素相关基因，涉及到叶绿素的合成、积累和降解途径，这个过程中任何一个基因发生突变，都可能会产生叶色突变体，但是这些突变体多为黄化、白化或条纹状突变体，如叶绿素 a 加氧酶(CHLOROPHYLL A OXYGENASE,CAO)1、光依赖性 NADPH：原叶绿素酸酯氧化还原酶 B(PROTOCHLOROPHYLLIDE OXIDOREDUCTASE B,PORB)2等基因突变。发掘大白菜叶色深绿相关功能基因的研究鲜有报道，其分子调控机制尚不明确。仅有的叶色深绿突变体又称为滞绿突变体，表现为植物在衰老阶段叶绿素降解缓慢或不降解，导致叶片出现持绿表型。拟南芥叶绿素 b还原酶(NON-YELLOW COLORING 1,NYC1)点突变导致未成熟花序在黑暗培养时出现持绿表型3。缺乏脱镁叶绿素酶(Pheophytinase,PPH)的拟南芥叶片保持常绿4。SGR1（STAYGREEN1）作为连通其他通路关键节点基因，在自然衰老和黑暗诱导情况下，sgr1-1 突变体表现出滞绿现象5，且在受生物胁迫和非生物胁迫时表型更为明显6，在芸薹属中，青梗菜SGR1 提前终止导致青梗菜在衰老过程中保持绿色7。甲基磺酸乙酯(Ethyl methylsulfonate，EMS)是人工诱变创新种质中应用最广泛的化学诱变剂，主要导致从 C/G 到 T/A 的单碱基突变8，染色体畸变相对较少，可以改良作物的某一种特定性状。本实验室利用 EMS 诱变大白菜叶色浅绿高代自交系A03(WT)的种子构建了表型变异丰富的大白菜突变体库，从中筛选获得了与营养品质、植株结构、器官形态、生长发育、产量构成等指标相关的多个突变体9-11。前期研究在该突变体库中筛选到一份叶色深绿突变体 dg，叶色深绿突变基因铁螯合酶 2(Ferroch-elatase-2，BrFC2)发生单碱基突变，可同时提高血红素和叶绿素含量12。本研究以大白菜叶色浅绿苏湘杰，等：大白菜叶色深绿突变体 dg 的转录组差异表达调控分析24第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报创建 cDNA 文库。库检合格后，使用 Illumina HiSeq测序平台进行高通量测序。1.2.4 转录组测序结果质控 使用 fastp 软件对测序原始数据进行处理，获得高质量的 Clean Reads；使用 HISAT2 软件将 Clean Reads 比对到大白菜 V3.0参考基因组（http:/brassicadb.org/brad/）上，获取Clean Reads 在参考基因组上的定位信息。1.2.5 差异表达基因鉴定及注释 以 FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）作为衡量转录本的丰度。使用