低氮胁迫下栽培大豆和野大豆幼苗适应性转录组学比较研究.pdf

第 卷第期东 北 师 大 学 报(自 然 科 学 版)V o l N o 年月J o u r n a l o fN o r t h e a s tN o r m a lU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c eE d i t i o n)J u n e 文章编号 ()D O I /j c n k i d s l k x b 收稿日期 基金项目国家自然科学基金资助项目();吉林省自然科学基金资助项目(J C);长春师范大学自然科学基金资助项目()作者简介李明霞(),女,博士,讲师,主要从事大豆逆境生理生态研究;通信作者:石连旋(),男,博士,教授,主要从事大豆生理生态研究低氮胁迫下栽培大豆和野大豆幼苗适应性转录组学比较研究李明霞,周际,胡勇军,韩德复,郭继勋,李淑英,张涛,石连旋(长春师范大学生命科学学院,吉林 长春 ;自然资源部国土整治中心,北京 ;东北师范大学生命科学学院,吉林 长春 ;内蒙古赤峰市敖汉旗林业和草原局,内蒙古 赤峰 )摘要以栽培大豆和野大豆幼苗为实验材料,人工模拟低氮胁迫,采用转录组测序技术(R NA s e q)测试分析了胁迫处理下栽培大豆和野大豆幼苗在转录水平发生的变化,揭示了野大豆抵御低氮胁迫的分子机制结果表明:野大豆能够通过促进根系生长维持较高的根冠比、增大根系与营养物质的接触面积吸收更多的氮抵御低氮胁迫低氮胁迫下野大豆和栽培大豆幼苗叶片中分别有 个和 个差异表达基因,根系中分别有 个和 个差异表达基因野大豆通过调控N R T、N R T 和AMT蛋白家族相关基因的表达来抵御低氮胁迫叶片中A P/E R F E R F、C H、C H、G R A S、MY B、N A C、T I F Y和WR K Y转 录 因 子,根 系 中C H、G R A S、MY B、N A C、T I F Y和WR K Y转录因子在野大豆抵御低氮胁迫的过程中起调控作用野大豆抵御低氮胁迫的关键是增强叶片中的半胱氨酸、蛋氨酸代谢和谷胱甘肽代谢,增强根系中的半胱氨酸、蛋氨酸、氰基氨酸代谢,N 聚糖生物合成、氨基糖和核苷酸糖代谢及糖酵解 关键词栽培大豆;野大豆;低氮胁迫;转录组学 中图分类号Q z 文献标志码A大豆是我国重要的经济作物和油料作物,为人类生活提供了 的脂肪和 的蛋白质野大豆是栽培大豆的近缘野生种,我国野大豆分布范围广泛且类型最多,目前我国的种质库收集、保存了 多份野大豆种质资源,占世界总资源的 左右野大豆具有蛋白质含量高、产量性状优越等诸多优点;同时,野大豆在不良环境胁迫条件下进化出很强的抗性,如耐盐碱、耐贫瘠、耐干旱、抗虫和抗病等野大豆与栽培大豆之间不存在生殖隔离,野大豆的优良性状为栽培大豆的育种提供了重要的基础,是提高栽培大豆抗逆能力的非常宝贵的野生种质资源 氮在植物的生命活动中占据首要地位,是农作物生长、发育和生产所必需的生命元素氮素在农业生产中直接或间接地影响农作物产量,对作物最终产量的贡献为 大豆是需氮量很高的植物,虽然与根瘤菌共生,但固定的氮仅占大豆一生需氮量的 ,不能满足其对氮素的需要低氮胁迫下,大豆幼苗叶片的光合速率比正常条件下降低了 在我国的农业生产中,氮肥施用量从 年的约 万t/a增加到了 年的约 万t/a,相比增加了 倍 农业生产中,施用过量的氮肥不但不能达到持续增产的效果,反而会导致作物氮肥效应报酬递减现象;此外,土壤中未被利用的氮肥还会造成严重环境污染问题 植物可以通过形态结构的可塑性和生理代谢的调控适应低氮胁迫植物能够通过增加根长、降低轴根第期李明霞,等:低氮胁迫下栽培大豆和野大豆幼苗适应性转录组学比较研究数、增加轴根长、刺激侧根生长及扩大根冠比等抵御低氮胁迫 ;而生理代谢的调控主要集中于保持较高的氮吸收量、氮转运率和氮利用效率,尽量提高氮的吸收量并对其进行有效的分配,从而维持植物正常的生命活动 已有研究 证实,耐低氮型野大豆能够通过增加根长来增强氮素吸收量,维持更强的光合作用能力和矿物质营养平衡能力,同时叶片还可以通过增强能量代谢以及酚类代谢抵御低氮胁迫随着生命科学技术的快速发展,转录组测序技术(R N A s e q)广泛应用于植物抵御低氮胁迫的研究中,主要侧重于探究植物在转录水平对低氮胁迫的响应、挖掘耐低氮基因、明确耐低氮基因型植物的耐低氮分子机制以及分析基因在低氮胁迫下的功能等方面 基于R N A s e q技术,对野大豆和栽培大豆抵御低氮胁迫转录水平的比较研究,对进一步揭示野大豆抵御低氮胁迫的分子机制至关重要,尤其是在同一试验系统中本文以野大豆和栽培大豆为实验材料,以沙基培养植物幼苗,通过人工配制低氮营养液模拟低氮胁迫处理,测定并分析了野大豆与栽培大豆的生长参数及生物量;同时,采用R NA s e q技术测定了野大豆和栽培大豆幼苗在低氮胁迫下的基因表达量,对差异表达基因进行了G O富集分析、K E G G通路富集分析、氮吸收转运相关基因分析和转录因子分析,进一步对野大豆和栽培大豆进行了比较分析,以揭示野大豆适应低氮胁迫的分子机制研究将为野大豆的资源评价及栽培大豆育种提供理论依据,同时也为植物资源的评价研究提供了新思路和新方法研究材料与方法 实验材料及培养栽培大豆(品种:J i n o n g,GM)和野大豆(保存号码:H u i n a n ,G S)的种子,其中栽培大豆由吉林省农作物新品种引育中心提供采用沙基培养实验幼苗,实验期间温度为白天/夜间()/(),空气湿度约为 低氮胁迫处理设计胁迫处理为对照(C K)和低氮胁迫(L N)两组对照组在实验期间以倍H o a g l a n d营养液浇灌;低氮胁迫组胁迫液用倍H o a g l a n d营养液配制,其中C a(NO)和KNO浓度为原 来倍H o a g l a n d营养液中浓度的/,缺失的C a和K分别由相等浓度的C a C l HO和K C l补足 生长参数测定在胁迫处理之前及胁迫处理 d后,分别选取栽培大豆幼苗和野大豆幼苗各盆,对株高、根长,地上、地下部分鲜重,地上、地下部分干重等生长参数进行测定 转录组学测试与分析采用天根D P 多糖多酚植物总R NA提取试剂盒提取样品的总R NA;利用N a n o D r o p 超微量分光光度计(T h e r m oS c i e n t i f i c l n c,D E,U S A)测量R NA的浓度;利用A g i l e n tB i o a n a l y z e r 系统(A g i l e n tT e c h n o l o g i e s液相色谱仪,C A,U S A)的R NAN a n o 分析试剂盒评估R NA的完整性每个样品用g的R NA作为R NA样品制备的输入材料,生成测序文库,并将索引代码添加到每个样品的属性序列中不同文库按照目标下机数据量进行池化,基于边合成边测序(S e q u e n c i n gB yS y n t h e s i s,S B S)技术通过I l l u m i n a高通量测序平台对c D NA文库进行测序原始数据(R a wd a t a)在进一步的数据分析之前先进行过滤,得到纯化数据(C l e a nr e a d s),以确定这些数据(r e a d s)有足够高的质量,保证后续分析的准确性本研究使用W i l l i a m s 作为参考基因组,将纯化数据(C l e a nr e a d s)与参考基因组进行序列比对,得到比对数据(M a p p e dd a t a)基因表达量差异倍数取的对数用l o gFC表示,设置P 且|l o gFC|为阈值,满足此条件表示基因表达量存在显著差异 用G O和K E G G数据库对所得到的差异表达基因进行注释并进行显著性富集,其中,G O显著性富集分析是以词条(T e r m)为基本单位,K E G G显著性富集分析以代谢通路(P a t h w a y)为基本单位在P 时,使用B l a s t G O程序对差异表达基因(D E G s)进行G O分类利用K E G G数据库在线分析D E G s的通路;利用M a p m a n(版本 ;h t t p:m a p m a n g a b i p d o r g/w e b/g u e s t)进行D E G s通路分析,将D E G s映射到W i l l i a m s 参考基础组上随机选择 个低氮胁迫下差异表达基因进行实时荧光定量P C R验证 G YMA G WM A V 作为内参基因使用P r i m e rP r e m i e r 软件设计q R T P C R引物,运用T b t o o l s软件对引物的专一性进行检验具体引物信息见表东 北 师 大 学 报(自 然 科 学 版)第 卷表差异表达基因荧光定量P C R引物序列基因编码正向引物序列()反向引物序列()G l y m a G Wm a v T G T T C C A G T T AT G T G C GA T AG C T C A T C A C G G T T C T T A G TG l y m a G Wm a v G C C A GA TA C A GAA G C A C T TC G C AA G G T A G T T C G C A T AG l y m a G Wm a v T T G T T C T T G T T A G C A C T T C CG T C C T C T A C C A C C A T C A T TG l y m a G Wm a v T GAA G GA G G T G GAGA C T GT T G C G T T A T G GA G T GAA C AG l y m a G Wm a v A T GA GA C C A C C G C A C T ATC T T C C A C T T C A C C A C C AA TG l y m a G Wm a v G G T G G T G G T G T T G T T C T TA T T C A T T G C C T G C GA GA GG l y m a G Wm a v C T G GA TA C T C G T GA C AA C AG C C T GAA C A GAA GAA T A T G CG l y m a G Wm a v T G G TAA G C AA T A C T C G T C T AA G C G T T G G T T C A T C A T A T T CG l y m a G Wm a v T C T GA T G G C A C C T GAT GAG C A C AA C T T C A C T T GA C T GG l y m a G Wm a v T G C T A T T G C G G T T GA G T T AT GA GAAG T T G C T G GAA GA GG l y m a G Wm a v C A C C T C C AA C AA C A C C AAC T C A G C A G C AA G T C C A T TG l y m a G Wm a v C C A C C A G T C T C AA C A T C A TA C AA C C T C AA C AA G T C A C AG l y m a G Wm a v G G T GA T G T G T T GAA GA C T GAAG T AA C T T GAAT G T GA GA G GA GAA结果分析 生长变化与对照组相比,野大豆幼苗的株高、地上鲜重、地下鲜重、地上干重和地下干重在低氮胁迫下分别下降了 倍、倍、倍、倍、倍(P ),而根长却比对照实验组增加了 倍(P )栽培大豆幼苗的株高、根长、地上鲜重、地下鲜重、地上干重和地下干重均在低氮胁迫下显著下降,与对照组相比分别下降了 倍(P )、倍(P )、倍(P )、倍(