藏猪和大约克猪FABP1基因多态性及差异表达分析.pdf

第 7 卷第 4 期 高原农业 Vol.7 No.4 2023 年 8 月 Journal of Plateau Agriculture Aug.2023 收稿日期：2022-11-03 作者简介：杨绍康（1996-），男，河南新乡人，硕士生。研究方向：动物遗传育种与繁殖。通信作者：强巴央宗（1965-），女，藏族，四川巴塘县人，教授，博士。研究方向：高原遗传资源保护与利用。基金项目：西藏自治区科技计划项目（XZ202202JD0002N）；西藏自治区重大科技专项项目（XZ202101ZD0005N）藏猪和大约克猪 FABP1 基因多态性及差异表达分析 杨绍康 常振宇 严飞飞 商 鹏 强巴央宗*（西藏农牧学院 动物科学学院/西藏特色农牧资源研发省部共建协同创新中心，西藏林芝 860000）摘要 本文旨在探究 FABP1 基因在猪脂肪沉积性状中所发挥的作用，试验选用 180 日龄藏猪与大约克猪，对藏猪和大约克猪 FABP1 基因 5侧翼区（起始密码子上游 3 000 bp 左右序列）进行了单核苷酸多态性（SNPs）位点筛选，并分析其对 FABP1 基因转录的影响。采用 RT-qPCR 检测两试验猪种在肝脏、背最长肌和背脂组织中的 FABP1 基因的 mRNA 相对表达量。结果显示，在 FABP1 基因 5侧翼区存在 A-1 717G、G-1 701A、C-1547T、T-1 523C、C-1 484A、C-1 453A、G-1377A、T-1 331G 共 8 个突变位点。在藏猪和大约克猪背最长肌、背脂和肝脏组织中 FABP1 基因的 mRNA 相对表达量趋势基本一致，FABP1 基因在两品种肝脏组织中的表达量最高。FABP1 基因在两品种间 8 个突变的位点的 P 值均为极显著差异，通过转录因子预测发现在 A-1 717G、C-1 484A、C-1 453A 以及 G-1 377A 四个位点中均存在与脂肪相关的转录因子出现或消失。综上，FABP1 基因可能为调控脂肪沉积的关键基因。关键词 藏猪；FABP1 基因；脂肪沉积；SNPs 中图分类号：S813.1 文献标识码：A 文章编号：2096-4781（2023）04-0400-09 DOI:10.19707/ki.jpa.2023.04.008 Analysis of FABP1 Gene Polymorphism and Differential Expression between Tibetan and Yorkshire Pigs YANG Shaokang,CHANG Zhenyu,YAN Feifei,SHANG Peng,Chamba yangzom(Animal Science College,Tibet Agriculture&Animal Husbandry University；The Provincial and Ministerial Co-founded Collaborative Innovation Center for R&D in Tibet Characteristic Agricultural and Animal Husbandry Resources,Nyingchi Tibet,860000,China)Abstract:The purpose of this paper was to explore the role of FABP1 gene in pig fat deposition traits.The 180-day-old Tibetan pigs and Yorke pigs were selected for the experiment,and gene sequence were screened for single nucleotide polymorphisms(SNPs)and their effects on FABP1 gene transcription were analyzed.In this experiment,RT-qPCR was used to detect the relative mRNA expression of FABP1 gene in liver,longissimus dorsi muscle and dorsal fat tissue of the two experimental pig breeds.The results showed that there were 8 mutation sites including A-1717G,G-1701A,C-1547T,T-1523C,C-1484A,C-1453A,G-1377A and T-1331G in the 5 flanking region of FABP1 gene.The relative mRNA expression trends of FABP1 gene in the longissimus dorsi,dorsal fat and liver tissues of Tibetan pigs and York pigs were basically the same,and the expression level of FABP1 gene was the highest in the liver tissues of the two breeds.The P values of the eight mutated loci in the FABP1 gene were highly significantly different between the two species,and the presence or absence of fat-related transcription factors was found in four loci,A-1717G,C-1484A,C-1453A and G-1377A,by transcription factor prediction.In 第 4 期 杨绍康等：“藏猪和大约克猪 FABP1 基因多态性及差异表达分析”401 conclusion,FABP1 gene may be a key gene regulating fat deposition and metabolism.Key words:Tibetan pig,FABP1 gene,fat deposition,SNPs 猪脂肪沉积性状是生猪生产中重要的经济性状。猪脂肪沉积的多少直接影响其生长速度、饲料转化效率、瘦肉率、肉品质以及繁殖性能，是消费者考虑的重要因素，直接关系着养猪行业的经济发展1,2。脂肪酸结合蛋白（FABPS）对影响体内脂肪的合成与降解发挥着重要作用，参与脂肪代谢、长链脂肪酸的转运及摄取3。FABPS 是胞内脂质结合蛋白超家族成员，参与细胞内脂肪酸的运输和体内脂肪的合成与降解，对细胞信号传导、增殖及分化具有重要的调控作用4。自20世纪70年代初Ockner和 Mishkin5首次发现 FABPs 以来，该家族的成员已经鉴定出九种，其中 FABP1 与细胞内脂质调节、核信号传导和细胞内脂肪酸运输等相关联，是目前受到广泛关注的一种脂肪酸结合蛋白家族成员。主要在肝脏和小肠细胞表达，其表达的蛋白质大量存在于细胞溶质之中5。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）属于遗传标记的一种，是近年来溯源研究方面的热点，其广泛存在与生物体基因组中存在，SNP 的数量庞大，且与生物体性状及表达密切相关6。它是最新的分子标记技术，以其数量多且分布广泛、检测快速、易于实现自动化、遗传稳定性高等优点，也被陆续应用在猪的肉质性状的研究中7。有研究表明部分位于基因内部编码区的 SNPs 可能引起蛋白质编码氨基酸序列的改变,这种变异会影响基因组 DNA 各组成元件的功能、转录产生的 mRNA 水平及蛋白质的表达，进一步会导致生物体性状或功能的改变8。藏猪是我国珍贵的地方猪种，主要活动于海拔2 5004 300 m 的青藏高原半农半牧区，具有四肢坚实、脂肪沉积能力强和肉质风味鲜美等特点，但存在体型短小、肥育周期长及背膘较厚等缺点9。本研究以西藏高原的藏猪和大约克猪作为研究对象，对 FABP1 基因 5侧翼区进行多态性分析；利用 RT-qPCR 技术，分析 FABP1 基因在两猪种肝脏、背最长肌以及背脂中的的差异表达情况，为进一步探究FABP1 基因在猪脂肪沉积性状中的机制奠定基础。1 材料与方法 1.1 试验材料 试验选取西藏林芝的藏猪和大约克猪为研究对象，采集180日龄藏猪（n=38）与大约克猪（n=42）耳组织，迅速置于含有 75%酒精的离心管中，-20 保存，用于提取总的 DNA。挑选在相同条件下采取不限饲的方式饲养至 180 days 且生长情况相近的藏猪和大约克猪各 10 头进行屠宰，采集其背最长肌、背脂以及肝脏组织置于装有 RNA 保存液的冻存管内，迅速放入液氮，-80 保存，用于提取 RNA。1.2 DNA、RNA 的提取及 cDNA 的合成 采用苯酚-氯仿法提取藏猪与大约克猪耳组织中的 DNA；采用 Trizol 法提取背最长肌、背脂及肝脏组织中的总 RNA，将 DNA、RNA 分别溶解于RNase-Free ddH2O 中，采用 NanoDrop 2000 检测DNA、RNA 的纯度和浓度；1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA、RNA 的完整性。采用 Fast King cDNA 第一链合成试剂盒（天根生化科技有限公司）将检测合格的 RNA 反转录为 cDNA，-20 保存。1.3 DNA 引物设计与合成 在 NCBI（htttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库下载猪 FABP1 基因（登录号：NC_010445.4）起始密码子上游 3 000 bp 左右区域 DNA 序列，使用PrimerPremier 5.0 软件设计引物（引物信息见表 1），并由生工生物工程（成都）有限公司合成。1.4 荧光定量 PCR 引物设计与合成 在 NCBI（htttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载402 高原农业 2023 年第 4 期 猪 FABP1 基因（登录号 NM_001004046.2）mRNA序列，选取GAPDH为内参基因，利用Primer Premier 5.0 设计引物（引物信息见表 2），用于实时荧光定量 PCR，由生工生物有限公司（成都）进行合成。表 1 FABP1 基因 5侧翼区引物序列 Tab.1 FABP1 gene primer sequence of 5 flanking region of gene 引物 扩增区域 引物序列（5-3）退火温度 产物大小 5-FABP1-1-185 至 262 F:ATGAACGCCACCTGTGCTG 56 817 bp R:ATCGGAGCCAGCCACTACT 5-FABP1-2-676 至-5 F:GCCCGAGGACTTTTGTATG 58 953 bp R:GTGG GAGTAGCCTCATTGC 5-FABP1-3-1213 至-672 F:AGTCCTCACCCACCCACAT 59 856 bp R:CCGAGGACTTTTGTATGCTGC 5-FABP1-4-1917 至-1069 F:TTGCCACTTTTCCCACTCC 57 849 bp R:GTATCAGGAAGGACCAGACAG 5-FABP1-5-2764 至-1923 F:AGGAAGTTGGGGAGAAGATTA 60 765bp R:AACCTCTTTGCCACTTTTCC 表 2 FABP1 基因定量 PCR 引物序列 Tab.2 FABP1 gene primer sequence of quantitative PCR