不同万寿菊粕水平对绵羊瘤胃细菌多样性的影响.pdf

动物营养学报，（）：不同万寿菊粕水平对绵羊瘤胃细菌多样性的影响陈颜旭，古再丽努尔艾麦提 郭同军 郭雪峰（新疆畜牧科学院饲料研究所，乌鲁木齐；塔里木大学动物科学与技术学院，阿拉尔）摘 要：本试验为了探索不同万寿菊粕水平对绵羊瘤胃细菌多样性的影响，采用单因素完全随机试验设计，选取体重为（）的杜泊羊湖羊杂交 代公羊 只，随机分为 个组，每组 只。各组饲喂不同饲粮，对照组（组）饲粮不添加万寿菊粕，组、组、组、组饲粮中分别添加、和 万寿菊粕。试验期 ，其中预试期 ，正试期。在第 天，从各组中随机选取 只公羊，经口腔采集瘤胃液，利用高通量测序技术进行瘤胃细菌多样性分析。结果表明：组样品共获得 个操作分类单元（），其中共有 个；组 指数极显著低于 组（），组显著低于 组（）。组 指数极显著低于 组（），组显著低于 组（）。组 指数极显著低于 组（）。各组在门水平的优势菌群为拟杆菌门和厚壁菌门。组拟杆菌门相对丰度极显著高于 组（），组显著高于 组（）；组和 组变形菌门相对丰度极显著低于 组（）；组、组和 组疣微菌门相对丰度极显著低于 组（），组显著低于 组（）；组和 组蓝藻菌门的相对丰度极显著低于 组（），组显著低于 组（）；组和 组浮霉菌门的相对丰度极显著高于 组（），组显著高于 组和 组（），组显著高于 组（）。属水平上的优势菌为普雷沃氏菌属、拟杆菌属、解琥珀酸菌属和奎因氏菌属。组普雷沃氏菌属相对丰度极显著高于 组（）；组解琥珀杆菌属相对丰度极显著低于 组（），组显著高于 组（），组和 组极显著低于 组（），显著低于 组（）；组和 组琥珀酸弧菌属相对丰度显著低于 组（）。组厌氧弧菌属相对丰度极显著低于 组（）。综上所述，在绵羊饲粮中添加万寿菊粕水平为 时，不会影响绵羊瘤胃菌群丰富度和多样性；当添加万寿菊粕水平在 时，会降低绵羊瘤胃菌群丰富度和多样性，改变绵羊的菌群结构，增加拟杆菌门和普雷沃氏菌属的相对丰度，且普雷沃氏菌属和密螺旋体属相对丰度与万寿菊粕水平有较强的正相关性。关键词：万寿菊粕；绵羊；瘤胃细菌；菌群多样性中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：新疆维吾尔自治区中央引导地方科技发展资金项目（）作者简介：陈颜旭（），男，重庆人，硕士研究生，研究方向为动物营养与饲料科学。：通信作者：郭同军，研究员，硕士生导师，：万寿菊（）为菊科、万寿菊属 年生草本植物，以花和根入药，具有清热解毒、止咳化痰等功效。据报道万寿菊花产量高，高产田鲜花产量可达 以上。万寿菊粕是万寿菊花经过提取叶黄素后的工业副产物，产量可观，如 果 开 发 利 用 得 当 可 以 缓 解 饲 草 资 源 不足。万寿菊粕的营养成分一定程度优于玉米秸秆、棉花秸秆等粗饲料。万寿菊粕中含有脂质类、酚酸类、生物碱、氨基酸及其衍生物、黄酮类化合物。研究表明，菊花中活性物质（如叶黄动 物 营 养 学 报 卷素类、挥发油类）具有抗氧化、提高免疫力、促进生长性能、改善畜禽产品品质等功能。前人研究主要集中在家禽、单胃动物、草食动物和水产养殖等方面，在反刍动物方面的相关研究较少，而反刍动物瘤胃是消化饲粮的重要器官，其中瘤胃内细菌最多也是主要的功能群落，另外反刍动物机体也受到微生物代谢的调控，其中饲料种类、组成比例均会影响瘤胃微生物区系，从而影响动物机体。大量研究表明，精粗比、饲养水平、饲料添加剂和饲料原料类型等变化均能调节瘤胃细菌群落多样性，改善瘤胃微生物区系。本课题组前期研究表明，万寿菊粕中含有的活性成分可对绵羊生长性能、血清生化指标和腹泻率产生一定影响。目前关于万寿菊粕对反刍动物瘤胃菌群调控的研究还鲜有报道，其是否影响瘤胃微生物区系以及微生物对宿主的互作关系有待探究。因此，本研究以绵羊为对象，利用高通量测序技术，通过添加不同水平的万寿菊粕，探究其对绵羊瘤胃内菌群组成及菌群变化的影响，以期为万寿菊粕开发和合理利用提供一定的数据支持。材料与方法 试验材料 万寿菊粕由新疆喀什某生物科技有限公司提供。试验动物及试验设计 在新疆喀什地区巴楚县喀什丰泰农牧科技有限公司羊场选取体重为（）的绵羊公羔 只，经驱虫后依据体重进行单因素完全随机试验设计，随机分为 个组，每组 只，每组小群饲养，其中对照组（组）饲粮不添加万寿菊粕，组、组、组、组饲粮中分别添加、和 万寿菊粕。预试期 ，正试期。试验饲粮与饲养管理 试验饲粮配制参考（）绵羊饲养标准，基于等能等氮原则配制体重 、日增重 的饲粮。具体饲粮组成及营养水平与本课题组前期试验一致，于每天：和：各饲喂 次，自由采食，自由饮水，每天每组保持的剩料量。样品采集 预试期和正试期结束后称重，用于平均日增重计算，第 天晨饲前，从各组中随机选取 只绵羊，用脚踏式瘤胃液采集装置经口腔采集瘤胃液，用 层纱布过滤，然后将收集的滤液立即放入液氮冻存，然后转置 冰箱保存，待后续送于北京百迈客生物有限公司，用 测序平台对细菌 基因进行高通量测序，。样品检测及生物信息分析 的提取：使用 天根生化科技（北京）有限公司提取瘤胃液中细菌，具体操作见说明书。扩增用引物：全长引物（）（）；（）（）。扩增程序：预变性 ，个 循 环（变性 ，退火 ，延伸 ），最后 延伸 。建库测序：提取样品总 后，根据 全长引物 和，合成带有 的特异引物，进行 扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库（），建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用 进行测序。下机数据为 格式，通过 分析软件导出 文件，根据 序列识别不同样品的数据并转化为 格式数据。数据预处理：将 下机数据导出为 文件（序列使用 提供的 工具获取）后，主要有如下 个步骤，）识别，使用 软件，通过 对 进行识别，得到 序列数据；）长度过滤，使用百迈客公司自主研发的软件，对 进行过滤，得到有效序列；）去除嵌合体，使用 软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到 序列。多 样 性 分 析：在 百 迈 克 生 物 云 计 算 平 台（）进行分析。相关性分析：云计算平台（）选择典范对应（）分析，选择属水平分析同时以万寿菊粕添加水平和平均日增重作为环境因子进行组间分析。数据处理采 用 统 计 软 件 进 行 分析并以 氏法进行多重比较，期陈颜旭等：不同万寿菊粕水平对绵羊瘤胃细菌多样性的影响 为差异极显著，为差异显著。数据结果采用“平均值标准差”表示。结果与分析 各组样本操作分类单元（）聚类分析 个瘤胃液样品测序后通过 识别后共获得 条 序列，每个样品至少产生 条 序列，平均产生 条 序列。共产生有效序列 条，经质量控制后得到 条高质量序列，序列长度为 左右。在基于序列相似性大于 的原则划分不同的，组、组、组、组和 组分别有、个，各组共有的 为 个。各组独有的 分别为、个，其中 组的特有 数最多，组和 组 数最少（图）。绵羊瘤胃细菌菌群 多样性及 多样性分析 由表 可知，覆盖率均约等于，表明本次每个样品的测序结果均能反映瘤胃的菌群结构。组 数极显著低于 组和其他各组（），组显著低于组和组（），其他各组间差异不显著（）。组 指数极显著低于 组（），组显著低于 组（），其余各组无显著差异（）。组 指数极显著低于 组（），组显著低于 组（），其余各组无显著差异（）。组 指数极显著低于 组（），其余各组差异不显著（）。不同颜色代表不同分组，由 图可看出不同组之间共有和独有的 数详细情况。，图 维恩图 表 瘤胃细菌菌群样本 多样性指数 项目 组 组 组 组 组 值 线性二次 数目 指数 指数 指数 指数 覆盖率 同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著（），不同小写字母表示差异显著（），不同大写字母表示差异极显著（）。下表同。，（），（），（）动 物 营 养 学 报 卷由 图 可 知，主 成 分 （）贡 献 率 为，主成分（）的贡献率为，用 非加权距离算法，不同颜色点代表各组中的样本，个样本间点间距越远表明物种组成有明显差异，点距越近表明物种组成相似。组和 组的样本点间距较大，表明 组的菌群组成较 组有明显差异。组相较 组距离较远，说明 组和 组的菌群结构有明显差异。组的置信圈与 组和 组的置信圈间距较近，且样本点较近且集中，说明这 组在 水平上菌群组成较为相似。图 不同万寿菊粕水平对绵羊瘤胃细菌菌群影响的主成分分析 由图 可知，组和 组的箱线图较为集中，表明组内差异较小。，表示各组间为中等差异，表明各组间差异极显著，这说明在本研究中采样或者分组没有出现较大问题，能够证实数据的有效性。绵羊瘤胃细菌门水平的组成分析 由表 可知，组拟杆菌门相对丰度极显著高于 组（），组显著高于 组（），其他各组差异不显著（），而随着万寿菊粕水平的增加各组在二次曲线趋势上无显著差异（）。组和 组变形菌门相对丰度极显著低于 组（），其他各组差异不显著（），各组在二次曲线趋势上无显著变化（）。组、组和 组疣微菌门相对丰度极显著低于 组（），组显著低于 组（），各组在二次曲线趋势上差异不显著（）。组和 组蓝藻菌门的相对丰度极显著低于 组（），组显著低于 组（），其他各组差异不显著（），各组在二次曲线趋势上无显著变化（）。组和 组浮霉菌门的相对丰度极显著高于（），组显著高于 组和 组（），组显著高于 组（），各组在二次曲线趋势上差异不显著（）。横坐标表示所有组间距离和不同分组，纵坐标表示不同的距离。一般：大差异；：中等差异，：小差异。等于 或在 附近，说明组间没有差异。，：；：；：，图 各组瘤胃菌群的相似性分析 绵羊瘤胃细菌属水平的物种组成分析 由表 可知，组普雷沃氏菌属相对丰度极显著高于 组（），其他各组差异不显著（），各组在二次曲线趋势上无显著差异（）。组解琥珀杆菌属相对丰度极显著低于 组和 组（），显著低于 组（），组和 组极显著低于 组（），显著低于 组（），组显著高于 组（），各组在二次曲线趋势上无显著差异（）。组和 组琥珀酸弧菌属相对丰度显著低于 组（），其他各组差异不显著（），各组在二次曲线趋势上差异不显著（）。组厌氧弧菌属相对丰度极显著低于 组和 组（），显著低于 组（），其他各组差异不显著（），各组在二次曲线趋势上无显著差异（）。期陈颜旭等：不同万寿菊粕水平对绵羊瘤胃细菌多样性的影响表 不同万寿菊粕水平对绵羊瘤胃细菌门水平相对丰度的影响 项目 组 组 组 组 组 值 线性二次拟杆菌门厚壁菌门变形菌门疣微菌门蓝藻菌门螺旋体菌门拟杆菌门浮霉菌门纤维杆菌门脱硫杆菌门表 不同万寿菊粕水平对绵羊瘤胃细菌属水平相对丰度的影响 项目 组 组 组 组 组 值 线性二次普雷沃氏菌属瘤胃球菌属拟杆菌属月形单胞菌属解琥珀杆菌属奎因氏菌属琥珀酸弧菌属动 物 营 养 学 报 卷续表 项目 组 组 组 组 组 值 线性二次密螺旋体属真杆菌属厌氧弧菌属 不同万寿菊粕水平和平均日增重与瘤胃细菌丰度的相关性分析 由图 可知，瘤胃微生物菌群的变化可能与万寿菊粕添加水平及绵羊平均日增重存在一定关联性，其中，普雷沃氏菌属、密螺旋体属相对丰度与寿菊粕添加水平有较强的正相关关系，琥珀酸弧菌属相对丰度和寿菊粕添加水平呈负相关关系。解琥珀杆菌属、厌氧弧菌属、真杆菌属、奎因氏菌属、瘤胃球菌属、月形单胞菌属、拟杆菌属相对丰度均与平均日增重呈正相关关系。：厌氧弧菌属；：解琥珀杆菌属；：普雷沃氏菌属；：密螺旋体属；：琥 珀 酸 弧 菌 属；：真 杆 菌 属；：奎因氏菌属；：瘤胃球菌属；：月形单胞菌属。图 万寿菊粕水平和平均日增重的 分析 讨 论 不同万寿菊粕水平对绵羊瘤胃细菌多样性的影响 瘤胃作为反刍动物重要的消化器官其功能的发挥离不开其中的各种微生物，而微生物的多样性与品种、年龄、饲粮、饲养环境等因素密切相关，。多样性能够反映出样本中物种的丰富度和多样性，其中 指数和 指数主要与微生物群落丰富度相关，其数值越大说明样品中的物种越多，丰富度越高；而 指数和 指数和微生物群落多样性相关，指数越大表明微生物群落多样性越高，指数越小表明微生物群落多样性越高。肖润等研究表明，在云南云岭牛饲粮中添加桑枝叶粉显著提高了 指数和 指数，改善了云南云岭牛瘤胃的微生物多样性。董春晓等发现，添加油菜秸秆组的湖羊瘤胃微生物群落多样性