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淡水渔业，2 0 2 3，53(4）：7 2-8 1Freshwater Fisheries2023年7 月Jul.2023不同浓度硫酸新霉素对生物絮团氨氮转化速率及抗生素抗性基因的影响杨逸尊，罗国芝1.2.3，谭洪新1.2.3（1.上海海洋大学，上海水产养殖工程技术研究中心，上海2 0 130 6；2.上海市水产动物良种创制与绿色养殖协同创新中心，上海2 0 130 6；3.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海2 0 130 6)摘要：为探究不同浓度硫酸新霉素对于生物絮团处理氨氮及抗生素抗性基因的影响，本实验对生物絮团水质及絮团指标、水体中抗生素含量和生物絮团中6 种抗生素抗性基因的含量进行了检测。结果显示：在氨氮转化的速率上，初次加药连续监测显示未添加组（A组）、0.5mg/L硫酸新霉素组（B组）、1mg/L硫酸新霉素组（C组）和3mg/L硫酸新霉素组（D组）的氨氮去除速率分别为（3.8 8 0.0 2）mgTAN/（g T SSh）、（2.2 2 0.0 3）mgTAN/(g TSSh)、（2.17 0.0 4）m g T A N/(g T SSh)和(1.7 2 0.0 2）mg TAN/(g TSSh)，氨氮去除速率A组B组 C组 D组。而间隔一个休药期(50 0 d）的第二次加药连续监测显示4个组的氨氮去除速率分别为(2.99 0.08)mg TAN/(g TSS h)、（2.98 0.0 3)m g T A N/(g T SS h)、（2.97 0.0 8)m g T A N/(g T SS h)和（5.10 0.0 3）m g T A N/（g T SSh），氨氮去除速率D组 A组 B组 C组。对水体抗生素检测发现，两次检测都未能测出水体中硫酸新霉素的存在。对抗生素抗性基因检测发现硫酸新霉素对于aph(3）-Ia、a p h(3）-a、a a c(6 ）Ib、a a c(3）I这四种基因具有较大的选择和富集的能力。但B组的各抗生素抗性基因的拷贝数均为最低。实验结束后对4个实验组的异养菌菌落数量进行检测，发现了B组的菌群群落数量相较其他3组有明显提升。比较结果表明硫酸新霉素在第一次加药时随着浓度提高，对氨氮转化速率的影响越大。但在第二次加药时，添加的硫酸新霉素浓度对氨氮转化速率无负面影响，而高浓度的硫酸新霉素可以促进生物絮团氨氮的转化，但会显著增加抗生素抗性基因的拷贝数。关键词：生物絮团；氨氮转化速率；硫酸新霉素；抗生素抗性基因中图分类号：S949文献标识码：A文章编号：10 0 0-6 90 7-(2 0 2 3)0 4-0 0 7 2-10近几年来，抗生素抗性基因引起了越来越多的关注1,2 ，而水产养殖行业被越来越多地认为是抗生素抗性细菌的重要来源和抗生素抗性基因的贮存库3。宏基因组学分析表明，抗生素选择压力显著影响了抗生素抗性基因谱的组成，显著促进了抗生素抗性基因的富集，包括相应的和非相应的抗生素抗性基因类型4。形成各种抗生素抗性基因的共存组合，共同选择多种抗生素耐药性。ZHAO等5 发现在同一种抗生素选择压力下，非对应抗生素抗性基因的丰度也升高，表明抗生素具有显著的共选择效应，表现出抗生素的特异型生物絮凝技术（biofloc technology,BFT）作为一种新兴的养殖技术，其主体生物絮团主要是水体中的大量微生物、饲料粪便残渣、有机碎屑和一些聚合物通过复杂作用相互絮凝而成的细菌团6 。目前，国内外对于抗生素在生物絮凝养殖技术中的使用研究较少，而硫酸新霉素在各种养殖及水处理系统中的使用也鲜有关注，故本实验选取了硫酸新霉素这种常用渔药，来探究不同浓度硫酸新霉素对生物絮团水质处理能力及抗生素抗性基因的影响。水体中细菌对硫酸新霉素产生耐药性共有三种途径7 ，其中最具普适性的就是由细菌自身产生修饰氨基糖苷类抗生素的酶，而这种修饰氨基糖苷类的酶又可以细分为三种，一种是以aph基因为代表的对氨基糖苷磷酸转移酶进行编码的抗生素抗性基因，一种是以aac基因为代表的对氨基糖苷乙酰转收稿日期：2 0 2 2-0 6-2 2；修订日期：2 0 2 3-0 3-17资助项目：上海市科学技术委员地方院校能力提升项目（2 30 10 50 2 30 0）第一作者简介：杨逸尊（1997），男，硕士研究生，专业方向为零交换水养殖系统研究。E-mail：8 2 0 7 9447 0 q q.c o m通讯作者：罗国芝。E-mail：g z h lu o s h o u.e d u.c n第4期移酶进行编码的抗生素抗性基因，最后一种就是以ant 基因为代表的对氨基糖苷核苷转移酶进行编码的抗生素抗性基因。本实验选取了5种硫酸新霉素抗性基因，包含了三种类别的氨基糖苷修饰基因，为用药后抗性基因的积累给出数据支持，也为抗生素在生物絮凝养殖技术中的使用提供参考。1材料与方法1.1实验装置与材料实验在上海海洋大学循环水养殖与工程实验室内进行，实验室为封闭空间，温度设定为2 5。反应容器为10 L透明圆柱形塑料桶，使用功率为37 0W的气泵（森森集团股份有限公司，型号：HG370）进行曝气，气石为球形石英曝气石，置于反应容器中心使水体和空气充分且均匀接触。实验用水经过提前2 4 h充分曝气以去除水中残留氯。絮团取自上海海洋大学循环水养殖与工程实验基地未添加过抗生素的罗非鱼养殖池，养殖密度约为2 0kg/m。添加的碳源为一水合葡萄糖（C,HizO。H,0，分析纯，含碳量为36.4%）；使用的饲料为通威鱼用膨化配合饲料（江苏省宿迁市沭阳县扎下镇，粗蛋白为31.0%，碳含量为37.3%），实验所用氯化铵（分析纯，纯度99.5%）及所有水质检测使用试剂均采购自国药集团化学试剂有限公司，所用抗生素均采购自合肥中龙神力动物药业有限公司。1.2实验设计与管理实验分为4组，每组三个平行，A组作为对照组不添加硫酸新霉素，B组添加0.0 2 g硫酸新霉素（休药期50 0 d），C 组添加0.0 4g硫酸新霉素，D组添加0.12 g硫酸新霉素。添加的药量根据硫酸新霉素的推荐使用量计算，其中B组为推荐使用量的一半，初始浓度为0.50 mg/L，C 组为推荐使用量，初始浓度为1.0 0 mg/L,D组为推荐使用量的3倍，初始浓度为3.0 0 mg/L。4组接种絮团后调节TSS至315 330 mg/L，水体体积为8 L。第一次加药连续检测每组投加10 mg/L氨氮（氯化铵溶液），实验期间反应器加盖并及时补充因蒸发流失的少量水分。实验开始时水体碱度为355375mg CaCOg/L，当低于150 mg CaCOg/L时添加适量小苏打以维持碱度。当所有组氨态氮以及亚硝态氮浓度降低并维持在0.5mg/L以内时视为第一次连续监测实验结束。维持系统培养直到休药期结束，加药进行第二次连续监测。杨逸尊等：不同浓度硫酸新霉素对生物絮团氨氮转化速率及抗生素抗性基因的影响1.3水质及絮团指标的检测方法水质指标检测先用注射器取10 mL絮团水样，再通过0.2 2 m针头滤器（上海航欧机电设备有限公司,型号：CollinsMCE0.22m）过滤后进行检测。检测方法见表1，检测仪器为分光光度计（上表1水质指标检测方法Tab.1 Water quality index detection method指标DO温度pHTANNO,-NNO;-NTSSVSSDOCTNDTNFV30 min碱度粗灰分粗脂肪粗蛋白73第二次加药连续检测每组投加10 mg/L氨氮（氯化铵溶液），实验期间反应器加盖并及时补充因蒸发流失的少量水分。实验开始时水体碱度为265285 mg CaCOg/L，当低于150 mg CaCO,/L时添加适量小苏打以维持碱度。当所有组氨态氮以及亚硝态氮浓度降低并维持在0.5mg/L以内时视为实验结束。絮团扩培实验前测定絮团的总悬浮固体（T SS）、30 分钟沉降体积（FV30min）、碱度、总氨氮（T A N）、亚硝态氮（NO,-N）、硝态氮（NO;-N）、溶氧（DO）、p H、温度、溶解性有机碳（DOC）、挥发性悬浮物（VSS）、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪等指标。实验开始后每两日测定所有组中 TAN、NO,-N、NO；-N和DOC 的浓度。实验结束后测定絮团TSS、FV30 mi n、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪、VSS 和水体中总异养细菌数量测量方法WTW全自动检测仪WTW全自动检测仪WTW全自动检测仪水杨酸钠法8 茶乙二胺法8 硫酸肼还原法8 重量法8 重量法9非色散红外线吸收法过硫酸钾氧化法8 过硫酸钾氧化法8 英霍夫管沉降酸碱指示剂滴定法重量法10 Floch 萃取法 元素分析仪74海优尼科仪器有限公司，型号：UV2000），总有机碳分析仪（岛津制作所,型号：TOC42 0 0），多参数手提测试仪（德国WTW，型号：Multi3430），105电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），碳氮元素分析仪（德国ElementarvariomaxCNS），马弗炉（协郝上海仪器科技有限公司，型号：SX2-4-10Y)。1.4石硫酸新霉素的检测水体中硫酸新霉素在第一次休药期结束和第二次加药3d后从各组实验水体中均匀抽取50 mL水样，通过0.2 2 m针头滤器过滤后通过冰袋运送至上海微谱化工技术有限公司进行检测。硫酸新霉素含量检测方法由LC-MS/MS外标法测定。液相型号为：Waters 1Cl a s s；质谱型号为：WatersTQS；色谱柱为：ACQUITY UPLcr HSS T3 1.8 m;柱温：35；进样量：5L；流动相为：0.1%甲酸水溶液和乙腈；流速：0.4mL/min。1.5生物絮团中抗生素抗性基因的采集与测定在第二次连续监测实验结束后从各组实验水体基因引物(5-3)F:GGCTTCGTGATGCCTGCTTint I 1R:CATTCCTGGCCGTGGTTCTF:ATGGACACAACGCAGGTCACaadBR:TTAGGCCGCATATCGCGACCF:ATGGGCTCGCGATAATGTCaph(3)-I aR:CTCACCGAGGCAGTTCCATF:TCTGAAACATGGCAAAGGTAGaph(3)-II aR:AGCCGTTTCTGTAATGAAGGAF:TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTAaac(6)-I bR:CTCGAATGCCTGGCGTGTTTF:TGAAACGCTGACGGAGCCTCaac(3)-IIR:GTCGAACAGGTAGCACTGAG1.7氨氮去除效率和氨氮去除速率及抗生素使用量计算公式NHt-N去除效率计算公式：R=100%(C;-C)/C;式中，R为NH-N的去除效率（%）；C;为初始的NHt-N质量浓度（mg/L)；C。为终末的NHt-N 质量浓度(mg/L)。NHt-N去除速率率计算公式：S=(C;-Cc)/(Tt)淡水渔业中均匀抽取150 mL水样，通过0.2 2 m滤膜抽滤后，将抽滤在滤纸上的絮团放进10 mL透明无菌离心管中，用干冰保存第一时间送至上海生工生物工程股份有限公司进行抗生素抗性基因的检测，实验所用引物通过PrimerPremier5.0软件设计，表2 为所用目的基因引物。1.6生物絮团中异养细菌的生物群落估算用稀释平板计数法来测定生物絮团中的异养细菌的群落数量。在对接种絮团扩培之前及扩培实验结束之后采集絮团水样。在无菌操作台中，取1mL均匀水样，根据菌群的大致数量用合适倍数的无菌生理盐水进行稀释。将各组稀释后的菌液用杀菌消毒后的干净三角玻棒均匀涂布在大豆酪蛋白琼脂培养基上（杭州百思生物技术有限公司）。将均匀涂布后的平板放入恒温生化培养箱中（上海精宏实验设备有限公司，型号：SHP-250），设定温度为35，培养时间为2 4h。最后对培养之后的菌落进行计数，菌落数（CFU/mL）为平板上所有菌落数量再乘以稀释倍数进行计算。表2 本实验所研究基因参考引物Tab.2 Reference primers for genes studied in this labTSSh)；C,为初始的NH