彩色马铃薯StANS1a基因的克隆及表达分析.pdf

华北农学报():收稿日期:基金项目:内蒙古农牧业创新基金项目()内蒙古自治区自然科学基金项目()作者简介:聂利珍()女内蒙古乌兰察布人副研究员博士主要从事马铃薯功能基因挖掘鉴定及分子育种研究彩色马铃薯 基因的克隆及表达分析聂利珍张志成谢 锐常 悦张琼琳韩平安羿 静(.内蒙古自治区农牧业科学院内蒙古 呼和浩特 .内蒙古自治区植物蛋白质组学重点实验室内蒙古 呼和浩特.乌兰察布市农林科学研究所内蒙古 集宁)摘要:花色苷是植物次生代谢过程中产生的黄酮类物质在花色苷合成途径中花色苷合成酶催化无色花色苷转化成有色的花色苷在植物器官着色过程中起重要作用 为了解彩色马铃薯花色苷合成途径中关键酶基因 的功能以红皮红肉的彩色马铃薯品种红美为试验材料利用 技术克隆花色苷合成酶基因通过生物信息学分析其特性并将其过表达到拟南芥中进行功能验证 结果显示该基因 序列长为 包含 完整的开放阅读框编码 个氨基酸残基 通过生物信息学分析克隆到的基因并将该基因命名为 登录号为 其氨基酸序列具有保守的结构域 和 分别位于氨基酸序列的 位和 位 在拟南芥中过表达 通过半定量 检测其转录水平转基因株系中都有 基因的表达且表达量较非转基因拟南芥高通过检测转基因植株中花色苷的含量发现转基因植株花色苷含量比非转基因植株高.表明 参与了花色苷的生物合成 同时也证明彩色马铃薯 基因在花色苷代谢途径中起着重要的作用关键词:彩色马铃薯 花色苷合成酶基因 基因克隆表达分析 花色苷中图分类号:.文献标识码:文章编号:():./.(.):.().().().期聂利珍等:彩色马铃薯 基因的克隆及表达分析 .().:花色苷是一种常见的水溶性植物色素其结构为花青素与糖类以糖苷键结合存在于植物各器官的细胞液中赋予其红、紫或蓝等五彩缤纷的颜色花色苷是植物次生代谢过程中产生的黄酮类物质在花色苷合成途径中花色苷合成酶()位于花色苷生物合成途径下游催化无色花色苷转化成有色的花色苷在植物着色过程中起重要作用 等在 年首先从玉米突变体中利用转座子标签法分离得到 基因之后陆续在紫苏()、可可()、草莓()等植物中分离出来 基因 进一步的研究表明将郁金香()、丹参()、茶 叶()、东 方 百 合()、紫萼玉簪()等植物的 基因进行超量表达都能促进转基因植株的花色苷积累 马铃薯()是全球第四大重要粮食作物其营养丰富除了具有基本的食用价值还具有特殊的保健功效 马铃薯薯肉主要为白色和黄色还具有紫、红、黑等颜色的薯肉这种具有彩色薯肉的马铃薯叫彩色马铃薯 它除了含有马铃薯的营养成分之外还含有丰富的花色苷 近年来马铃薯中参与花色苷生物合成的相关基因研究也取得了一定的进展 研究人员在马铃薯中过表达了 基因结果显示转基因马铃薯块茎中的花色苷含量和块茎颜色显著提高 已有的研究表明 基因在彩色马铃薯中的转录表达明显高于黄色马铃薯在马铃薯中过表达 基因可以提高转基因马铃薯块茎中花色苷的积累尽管在许多植物中已克隆了 基因并进行相关的研究但彩色马铃薯中该基因的研究还鲜见报道 本研究根据彩色马铃薯薯肉的特性克隆其 基因的 序列通过生物信息学分析其同源性及进化特性并将其过表达到拟南芥中进行功能验证揭示 基因在转基因拟南芥中的表达与花色苷积累的关系以期为了解彩色马铃薯花色苷合成途径中关键基因的功能奠定试验基础同时也为彩色马铃薯的分子育种提供技术指导 材料和方法.试验材料彩色马铃薯品种红美块茎作为基因克隆的试验材料野生型拟南芥 生态型()种子作为转基因受体材料.设计基因的特异引物根据 数据库中报道马铃薯 基因()的 序列通过 设计基因的特异引物如下:.彩色马铃薯块茎总 提取及逆转录选用块茎的薯皮和薯肉作为试验材料提取其总 具体详细的提取方法见参考文献和的试验方法 吸取 总 样品作为反转录模板按照反转录试剂盒(宝生物)的操作步骤进行反转录合成 获得块茎的 样品以此 进行 扩增.彩色马铃薯花色苷合成酶基因 扩增以反转录合成的 为模板利用/作为特异引物进行 扩增扩增程序为:个循环 电泳检测结果利用纯化回收试剂盒回收 产物.基因的连接及测序将纯化回收的 产物与克隆载体(载体)进行连接然后将连接产物转化大肠杆菌 过夜培养后挑取单菌落进行菌落 验证验证正确后选取阳性菌液测序用上述质粒作为模板/作为引物进行 扩增扩增程序同上纯化回收 产物连接 载体转化农杆菌获得 质粒.基因的生物信息学分析利用 对 基因序列进行比对分析根 华 北 农 学 报 卷据 数据库中获得的马铃薯()和其他植物基因序列利用 软件对克隆基因进行氨基酸序列及多序列相似性比对利用 软件在线预测克隆基因的理化特性根据 .软件对多种物种来源的 序列构建系统进化树.植物表达载体的构建用 和 双 酶 切 植 物 表 达 载 体 和 载体分别回收大片段和目的片段然后利用 连接酶(美国)连接连接产物通过冻融法转化大肠杆菌感受态细胞 过夜培养后挑取单菌落进行菌落 鉴定鉴定正确即完成了植物表达载体的构建 采用冻融法将 基因导入农杆菌 通过菌落 鉴定阳性菌落验证正确后挑选阳性菌落摇菌菌液 保存备用用于侵染拟南芥.转基因拟南芥的获得在 管中装入拟南芥种子用 的乙醇消毒 再用 次氯酸钠消毒 用无菌水洗 次点种在/培养基上 黑暗条件下春化 然后置于 光照/黑暗光周期、/()、湿度为 条件下培养 后选择生长健壮的幼苗移栽到培养土中 当幼苗生长 左右抽薹时进行转化转化前将已经开放的花和种子剪除干净 将冷冻保存的农杆菌菌液活化培养后重悬于渗透缓冲液中调节菌液浓度.将拟南芥花器浸入农杆菌悬浮液 继续生长约 收获种子 通过含有潮霉素的培养基筛选转基因植株和纯合植株.花色苷含量测定根据 等的方法进行花色苷含量的测定每个样品都选用 左右的转基因和非转基因拟南芥植株 棵称质量后加入 甲醇(/)提取液混合均匀 提取 其间每隔 颠倒混匀 次 处理结束后 条件下 /离心 吸取上清液至新的离心管 花色苷采用分光光度计进行检测每个样品分别读取 下的吸光值进行测量每个样品 次生物学重复使用以下公式确定相对花色苷水平:花色苷的相对单位/新鲜组织的质量 (.)提取体积()/组织样品的质量().检测分别提取转基因拟南芥和非转基因拟南芥植株的总 按照反转录试剂盒(宝生物)操作步骤进行反转录合成 作为模板进行转基因植株的 检测 扩增的引物分别为:扩增 基因的特异引物为 和 扩增片段跨 基因内含子扩增 片段长度为 拟南芥内参基因引物为和 扩 增 片 段 长 度 为 结果与分析.彩色马铃薯 基因的 扩增以反转录获得的彩色马铃薯 为模板利用/作为引物扩增获得长度约 的特异性条带(图)产物回收纯化后连接转化大肠杆菌对挑取的单克隆进行菌液 验证其结果见图 将 验证为阳性的菌液送公司测序结果显示所得 片段长度为 (图)通过比对分析其包含一个 完整的开放阅读框编码 个氨基酸残基(图)比对后发现该序列与马铃薯()基因序列相似度达到.(图)而开放阅读框相似度为.氨基酸相似度为.(图)通过对其氨基酸序列编码蛋白质结构域比对发现碱基改变未引起蛋白质结构域改变并且具有保守的结构域 和.基因克隆.验证阳性菌落.随机菌落.图 基因的克隆.期聂利珍等:彩色马铃薯 基因的克隆及表达分析 .基因 序列.氨基酸序列.多肽链 端.图 基因 序列和氨基酸序列.华 北 农 学 报 卷分别位于氨基酸序列的第 位和第 位(图)表明克隆得到的序列为马铃薯 基 因 序 列 命 名 为 (:).与 间基因比对.与 间氨基酸比对.图 与 间基因和氨基酸的同源性比对.理化性质分析利用 软件分析 氨基酸的理化性质结果显示 蛋白质是由 个氨基酸残基组成的分子式为 原 期聂利珍等:彩色马铃薯 基因的克隆及表达分析 子总数为 个分子质量约为.其中带正、负电荷的氨基酸残基分别有 个理论等电点()是.不稳定系数.平均亲水系数.表明 蛋白属于亲水性的不稳定蛋白质(图)图 蛋白质的疏/亲水性分析./.蛋白质的相似性比对分析根据 数据库中其他植物 的氨基酸序列利用 软件分析以下几种植物的 氨基酸序列的相似性如马铃薯 ()、番茄(.)、茄子(.)、辣椒(.)、烟 草 (.)、拟南芥(.)、苹果(.)、大豆(.)、黑果枸杞(.)、澳洲棉(.)、葡萄(图 与其他植物 氨基酸序列相似性的比对分析.)、胡桃(.)、可可(.)、榴莲(.)、阿月浑子(.)、覆盆子(.)由图 可知 基因在氨基酸水平与 和番茄 相似性达到 而与茄子、辣椒、烟草、拟南芥、苹果 和大豆 等氨基酸序列的相似性也都超过了它们在氨基酸水平具有很高的相似性揭示了在植物中 基因的氨基酸序列具有极强的保守性也可能说明了不同植物 蛋白质功能具有较高的相似性.构建 蛋白质的系统进化树根据 数据库比对分析选用与 氨基酸序列同源性较高的其他植物 的氨基酸序列分别为马铃薯()、番茄(.)、茄 子(.)、辣 椒(.)、烟草(.)、黑果枸杞(.)、澳洲棉(.)、葡萄(.)、胡桃(.)、可可(.)、榴莲(.)、苹果(.)、阿月浑子(.)、覆盆子(.)和拟南芥(.)利用 软件构建系统进化树由图 可知在初级聚类中首先聚合成 大分支其中 与同为茄科的马铃薯、番茄、茄子聚在同一个分支其亲缘关系较近其他的聚为另一个分支亲缘关系较远进化树的构建也反映了一些物种亲缘关系的远近.植物表达载体的构建用 和 双 酶 切 植 物 表 达 载 体(图)和克隆载体 分别回收大片段和小片段将所得大片段与酶切所得的 基因的 小片段用同源重组连接酶重组连接转化至 感受态细胞挑取阳性菌落进行菌落 验证载体测序验证构建好的植物表达载体见图 最后将构建好的植物表达载体转入农杆菌中菌落 验证阳性菌落(图)证实彩色马铃薯 基因已转入农杆菌中.基因转化拟南芥将含有 基因的植物表达载体通过农杆菌介导法转入拟南芥中将收获的种子种植于含有潮霉素的培养基中利用转基因种子带有抗性基因在含有潮霉素的培养基中仍然能正常生长而非转基因种子不能生长而死亡来筛选转基因植株 通过筛选获得了转基因拟南芥 纯合种子 华 北 农 学 报 卷各节点处数字表示 值(重复 次)().图 马铃薯与其他植物 系统进化树构建.酶切 和 载体.构建的植物表达载体图谱.菌落 验证.随机单菌落.图 基因植物表达载体的构建及载体图谱.转基因植株中 的相对定量分析为了验证转基因拟南芥植株中 基因的转录水平随机挑选 个转基因植株利用 的特异引物/以拟南芥的 基因作为内参基因通过 检测 在转基因拟南芥中的表达 由图 可知 株转基因植株中都有 基因的表达只是表达量稍有不同 期聂利珍等:彩色马铃薯 基因的克隆及表达分析 图 转基因株系 分析.转基因拟南芥中花色苷含量的测定为了验证 基因参与花色苷的积累本研究测定了不同转基因拟南芥株系中花色苷的含量由图 可知部分转基因株系内花色苷含量与非转基因拟南芥相比有显著差异(.)最高 比非转基因拟南芥高.其次为 比非转基因拟南芥高.比非转基因拟南芥高.比非转基因拟南芥高.比非转基因拟南芥高.最低为 比非转基因拟南芥略高.不同的字母代表转基因拟南芥与 的差异达显著水平(.)(.).图 转基因植株中花色苷含量.结论与讨论花色苷是植物黄酮类化合物中最大的一类在许多植物中主要呈现红色和蓝色 花色苷在合成过程中需要多种酶的参与如、和 等 其中 是花色苷生物合成途径末端的关键酶对植物的成色起着关键作用是其生物合成途径中重要的结构基因 本研究从彩色马铃薯块茎中克隆到 个包含 的完整开放阅读框编码 个氨基酸残基的花色苷合成酶基因的 序列 分析比对后发现该序列部分碱基发生改变但与 序列相比蛋白质结构域未发生变化具有 保守的结构域 和这些 的保守结构域与其他植物是一致的 进化分析表明 与同为茄科的马铃薯、番茄和茄子处在同一分支亲缘关系最近与苹果和拟南芥等亲缘关系较远这与植物学传统分类一致 本研究构建了 过表达载体转化拟南芥转基因株系中 基因的转录水平较非转基因植株有了明显提高这与杨成龙等将东方百合 转入拟南芥转基因株系 基因的表达量显著上升的结果是一致的 转基因植株花色苷含量比非转基因植株中高.这些结果证实 基因具有花色苷合成酶的功能且促进了转基因拟南芥中花