藏药蓝玉簪龙胆的种子萌发和愈伤繁殖特性.pdf

2023 年 6 月第 3 期97105甘肃农业大学学报 JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSITY第5 8卷双 月 刊藏药蓝玉簪龙胆的种子萌发和愈伤繁殖特性郑晓雯1，3，4，张思思1，郑冰洁1，冯勇强1，褚晖1，巨秀婷1，3，4，才桑加2，李长慧1，徐庭亮1，3，4（1.青海大学，青海 西宁 810016；2.青海洮河源湿地公园管理服务中心，青海 西宁 810016；3.青海大学高原花卉研究中心，青海 西宁 810016；4.青海省园林植物与观赏园艺重点实验室，青海 西宁 810016）摘要：【目的】为保护蓝玉簪龙胆的种质资源，探索其人工繁育方法。【方法】试验采用浸种和组织培养技术，通过不同培养基和不同激素的筛选，讨论蓝玉簪龙胆种子萌发以及愈伤组织分化的最佳策略。【结果】蓝玉簪龙胆种子在200 mg/L GA3处理4 h发芽率最高，为44.84%；在不同基本培养基中培养，B5培养基萌发效果最佳，发芽率达53.21%。以B5培养基为基础，向培养基中添加不同浓度的GA3、NAA和6-BA，得到蓝玉簪龙胆种子萌发的最优培养基为：B5+0.5 mg/L GA3+1 mg/L 6-BA，发芽率达 66.01%；诱导愈伤组织生长的最适宜培养基为：B5+0.5 mg/L GA3+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，诱导率为34.28%。以愈伤组织生长最适培养基为基础，添加不同浓度6-BA，进一步优化培养基配方，得到最适合蓝玉簪龙胆愈伤组织继代培养的方案：B5+0.5 mg/LGA3+0.5 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA。【结论】愈伤组织继代培养方案可以将蓝玉簪龙胆从种子分化成愈伤组织，再分化成幼苗。关键词：蓝玉簪龙胆；人工繁育；种子萌发；愈伤诱导中图分类号：S567.23+9 文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文章编号：1003-4315（2023）03-0097-09Characteristics of seed germination and callus propagation of Tibetan medicine Gentiana veitchiorumZHENG Xiaowen1，3，4，ZHANG Sisi1，ZHENG Bingjie1，FENG Yongqiang1，CHU Hui1，JU Xiuting1，3，4，Caisangjia2，LI Changhui1，XU Tingliang1，3，4（1.Qinghai University，Xining 810016，China；2.Qinghai Taoheyuan Wetland Park Management Service Center，Xining 810016，China；3.Plateau Flower Research Center，Xining 810016，China；4.Key Laboratory of Landscape Plant and Horticulture of Qinghai Province，Xining 810016，China）Abstract：【Objective】The study aimed to explore artificial breeding approaches of the Gentiana veitchiorum in order to protect its germplasm resources.【Method】The best conditions for seed germination and callus differentiation of G.veitchiorum was determined by using seed soaking and tissue culture techniques and screening of different media and different hormones in the experiment.【Result】The germination DOI：10.13432/ki.jgsau.2023.03.013第一作者：郑晓雯，硕士研究生。E-mail：通信作者：徐庭亮，讲师，博士，主要从事藏高原野生植物开发与利用相关研究。E-mail：基金项目：青海省科技厅基础研究计划（青年基金，2023-ZJ-982Q）；青海省“昆仑英才科技领军人才”培养项目（青人才字 2022 1号）；2021洮河源国家湿地公园湿地保护与恢复项目（2021-thy-1）；青海大学第五批创新创业工坊（GF-20230002）；青海大学2023年大学生科研训练计划（SRT）项目（SRT202311）；青海大学农牧学院大学生创新创业训练计划项目（2022）。收稿日期：2023-03-31；修回日期：2023-04-19甘肃农业大学学报2023 年rate of G.veitchiorum seeds was the highest when treated with 200 mg/L GA3 for 4 h，which was 44.84%.Cultured in different basic media，the seeds had the highest germination rate on B5 medium（i.e.，53.21%）.With adding different concentrations of GA3，NAA and 6-BA to basic B5 medium，it was showed that the optimal medium for seed germination of Gentiana veitchii was B5+0.5 mg/L GA3+1 mg/L 6-BA，on which the seed germination rate was 66.01%.The optimal medium for callus induction was B5+0.5 mg/L GA3+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，on which the induction rate was 34.28%.Based on the optimal medium for callus growth，the medium formula was further optimized by adding different concentrations of 6-BA，and the most suitable scheme for callus subculture was obtained as follows：B5+0.5 mg/L GA3+0.5 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA.【Conclusion】The G.veitchiorum seeds can be differentiated into callus，and then into seedlings by using the callus subculture scheme.Key words：G.veitchiorum；artificial breeding；seed germination；callus induction蓝玉簪龙胆（Gentiana veitchiorum Hemsl.）藏语学名为“邦见温保”，龙胆科龙胆属，是青藏高原特有的多年生草本植物，其花冠形状同“喇叭状”，呈蓝色或深蓝色，极具观赏价值1。蓝玉簪龙胆作为传统的中藏药，因其地上部位的提取物富含类黄酮，生物碱和环烯醚萜苷类等次生代谢产物，而被认为具有清热解毒和清热利胆的功能2-3。现代医学表明它可以用于治疗肝脏黄疸，急性肝病，天花，头痛和呼吸道感染等疾病，并且现以蓝玉簪龙胆为原料的成药产品有龙胆泻肝汤、蓝玉簪龙胆花漱口剂等4-7。因其具有重要的产业价值，对原材料需求逐年上升，但目前获取蓝玉簪龙胆植株仍靠人工采挖，导致产品产量稳定性差，品质层次不齐，同时野生群体稳定性被破坏，进而导致生态系统次生危害激增8。为了缓解蓝玉簪龙胆野生植物资源枯竭，最大限度地满足药品、保健品等生产用原料的需求，本试验通过研究其种子的萌发和愈伤组织的特性，建立人工繁育体系，促进该药用植物资源的永续利用。由于青藏高原的特殊地理环境因素，导致蓝玉簪龙胆种子体积很小，所以种子内的营养物质也很少，使得真正能够成熟且正常萌发的种子数量十分有限，同时恶劣的气候又使落地种子的活力不断下降，致使蓝玉簪龙胆在自然状态下萌发率极低9-10。组织培养是一种在不受季节变化的影响的前提下，能够提高种子萌发率和快速繁殖植物的一种常用的生物技术手段，不仅可以保存植物的种质资源且能够优化和增强其生物合成11。迄今为止，蓝玉簪龙胆的组织培养只有茎段培养技术的研究12。但茎段的繁殖材料数量有限，植株遗传性状较稳定，无法通过诱变育种进行品种改良。本研究在前人的基础上，拟通过赤霉素处理，探究野生蓝玉簪龙胆种子萌发特性；为进一步提高种子的发芽率，试验将种子接种在不同基础培养基和不同激素配比的培养基中，获取最适合种子萌发和诱导愈伤组织生长的方案；最后对促进愈伤组织生长的方案进行优化，获取促进愈伤组织继代培养的最优方案。试验旨在探究蓝玉簪龙胆种子萌发和愈伤组织生长特性，改进播种繁育技术，以期为蓝玉簪龙胆人工种子的获取和系统开发、多元利用提供技术和理论参考。1材料与方法1.1试验材料试验材料用蓝玉簪龙胆种子于2021年9月在青海洮河源国家湿地公园（N 3432 1 3412 25，E 10156 20 10208 52）采集，并将种子储存在牛皮纸袋中，晾晒干燥后保存备用。1.2试验方法1.2.1赤霉素打破休眠处理蓝玉簪龙胆种子经白猫漂水消毒20 min，参考刘美茹等的方法将消毒后 的 种 子 分 别 以 赤 霉 素 浓 度 为 0、200、300、400 mg/L的溶液和浸泡30 min和4 h处理，随后将不同浓度不同浸泡时间处理组合的种子平铺在有湿滤纸的培养皿中，每个处理设置3次重复13。随后置于光照培养箱（40%的相对湿度，白天25/16 h；黑夜20/8 h）中进行常规培养，全程保湿。于7 d后观察种子萌发情况并统计发芽率。1.2.2基本培养基的筛选蓝玉簪龙胆种子经白98第 3 期郑晓雯等：藏药蓝玉簪龙胆的种子萌发和愈伤繁殖特性猫漂水消毒20 min，利用试验1.2.1筛选出的最适合的打破种子休眠赤霉素的方案处理种子，然后接种在 5种不同基础培养基上，即 1/2 MS 培养基、1/4 MS培养基、3/4 MS培养基、MS培养基和B5培养基（MS 培养基中微量元素分别为原来的 1/2、1/4和3/4，配成1/2MS、1/4MS培和3/4MS培养基。MS和B5培养基配方见表12）。每个处理设置3个重复，每个重复做6皿技术重复，每皿3050粒种子，然后置于光照培养箱（40%的相对湿度，白天25/16 h；黑夜20/8 h）中进行常规培养，于培养7 d后观察种子萌发情况并统计蓝玉簪龙胆种子的发芽率。1.2.3不同激素浓度对种子发芽和愈伤组织的影响在试验1.2.2的基础上，将种子接种于添加不同浓度和种类激素配比的培养基中，按表3拟正交试验组合27组处理，每个处理设置3次重复，每个重复接种3皿，于接种后7 d开始观察种子萌发情况，2周后开始观察愈伤生长情况，筛选出蓝玉簪龙胆种子发芽和愈伤组织生长的最优培养基培养配方。种子发芽率（%）=发芽种子数/总种子数100%愈伤组织诱导率（%）=愈伤组织数/总种子数100%1.2.46-BA对愈伤组织诱导的影响为促进诱导蓝玉簪龙胆愈伤组织的生长，从试验1.2.3中所选出的诱导蓝玉簪龙胆愈伤组织生长的最优方案的基础上进一步优化，在此培养基上繁育愈伤组织，然后控制 GA3和 NAA 的激素浓度，添加 0.20（C1处理），0.5