藏药诃子质量标志物诃黎勒酸的标准化分析研究.pdf

分析测试新成果(140 148)藏药诃子质量标志物诃黎勒酸的标准化分析研究宋志博1,5，陈涛1,5，王肖波2，王岱杰3，申诚1，王硕1，李洪梅1,5，海平4，李玉林1（1.中国科学院 西北高原生物研究所，青海 西宁810001；2.中国科学院 西北生态环境资源研究院，甘肃 兰州730000；3.山东省分析测试中心，山东 济南250014；4.青海省药品检验检测院 国家药品监督管理局中药（藏药）质量控制重点实验室，青海 西宁810016；5.中国科学院大学，北京100049）摘要：以藏药诃子为原料，研制诃黎勒酸国家标准样品.诃子经 60%乙醇提取，大孔树脂富集，制备液相色谱技术得到诃黎勒酸标准品.采用高效液相色谱（HPLC）、液相色谱-质谱（LC-MS）和薄层色谱（TLC）等手段进行纯度分析.采用紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、高分辨质谱（MS）和核磁共振波谱（NMR）技术进行结构确认.最后进行均匀性、稳定性和联合定值.结果表明，诃黎勒酸样品均匀性良好，4 储存，24 个月内稳定.联合定值确定诃黎勒酸纯度标准值为 99.33%，符合国家标准品的要求.研制出的诃黎勒酸（GSB 11-3724-2020）国家标准样品，可用于含量测定、检测方法评定、相关产品的检测与质量控制.关键词：诃黎勒酸；标准样品；均匀性；稳定性；定值中图分类号：TQ460.7+2 文献标志码：B 文章编号：1006-3757（2023）02-0140-09DOI：10.16495/j.1006-3757.2023.02.002Standardization of Chebulagic Acid as Quality Marker of TibetanMedicine Terminalia ChebulaSONG Zhibo1,5，CHEN Tao1,5，WANG Xiaobo2，WANG Daijie3，SHEN Cheng1，WANG Shuo1，LI Hongmei1,5，HAI Ping4，LI Yulin1（1.Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Sciences,Xining 810001,China；2.NorthwestInstitute of Eco-Environment and Resources,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China；3.ShandongAnalysis and Test Center,Jinan 250014,China；4.Qinghai Provincial Drug Inspection and Testing Institute,NMPA Key Laboratory for Quality Control of Traditional Chinese Medicine and Tibentan Medicine,Xining810016,China；5.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China）Abstract：A certified reference material of chebulagic acid has been developed using a Tibetan medicine TerminaliaChebula as the raw material.Terminalia Chebula was extracted with 60%ethanol,enriched by the macroporous resin and 收稿日期：20230302；修订日期：20230516.基金项目：青海省重点研发与转化计划：藏药质量标志物发掘和标准化关键技术及应用示范(2023-SF-112)，甘肃省青年科技基金计划(20JR5RA542)Key Research,Development and Transformation Plan of Qinghai Province:KeyTechnologies of the Exploration and Standardization of Quality Markers from Tibetan Medicine and Its ApplicationDemonstration(2023-SF-112),Gansu Youth Science and Technology Fund Program(20JR5RA542)作者简介：宋志博（1995），男，硕士研究生，研究方向：藏药物质基础和标准化研究，E-mail：通信作者：海平（1964），男，研究员，研究方向：中藏药药理及质量控制研究，E-mail：；李玉林（1970），男，博士，研究员，分析测试技术与仪器编委，研究方向：藏药标准化与创新药物研究，E-mail：.第 29 卷第 2 期分析测试技术与仪器Volume 29 Number 22 0 2 3 年 6 月ANALYSIS AND TESTING TECHNOLOGY AND INSTRUMENTSJune 2023 through the preparative liquid chromatographic purification to obtain chebulagic acid.The purity analysis was carried outby high performance liquid chromatography(HPLC),liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS)and thin-layerchromatography(TLC).The structure was identified using ultraviolet(UV)spectroscopy,infrared(IR)spectroscopy,mass spectroscopy(MS)and nuclear magnetic resonance(NMR)spectroscopy.Finally,the homogeneity,stability andcooperative certification were carried out.The results indicated that the chebulagic acid has a good uniformity and a finestability within 24 months at 4.The standard value of the purity of chebulagic acid was 99.33%,which was inaccordance with the requirements of the certified reference material.The developed chebulagic acid(GSB 11-3 724-2020)can be used for the content determination,method evaluation,testing and quality control of related products.Key words：chebulagic acid；reference material；homogeneity；stability；certification 标准样品是经过技术鉴定，附有有关性能数据证书的一批样品，可以用来校准仪器、评价测量方法、给材料赋值1-2.天然产物标准样品的地位在中药现代化的发展中日益凸显，特别是在检测结果的准确性、溯源性和药材质量控制方面起着不可替代的作用3-6.藏药诃子是使君子科植物诃子 Terminaliachebula Retz.干燥成熟果实，长圆形或卵圆形，表面黄棕色或暗棕色.诃子味苦、酸、涩，性平，归肺、大肠经，用于久泻久痢、便血脱肛、肺虚喘咳、久嗽不止、咽痛音哑等症状7.诃子在藏药中具有重要地位，在卫生部药品标准藏药第一册（部颁标准）常用 200则藏药方剂中，使用诃子入药的有 125 种，素有“藏药之王”的美称8.诃子中化学成分十分丰富，主要包括鞣质类、酚酸类、三萜类、黄酮类、挥发油类、脂肪族类等9.目前市售诃子的质量参差不齐，更是有伪品混杂其中，药典中对诃子的质量控制局限于性状、显微及薄层色谱鉴别，缺乏对质量标志性成分的含量测定.在诃子质量标志物预测研究报道中，经多个角度的预测分析表明诃黎勒酸是可能的质量标志物之一10，具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗菌等药理作用11-15.目前，国内外还未研发出诃黎勒酸的国家标准样品.本研究围绕诃子中的质量标志成分诃黎勒酸，参照标准样品工作导则，开展了标准化分析研究，成功研制了诃黎勒酸国家标准样品（GSB 11-3724-2020）（如图 1 所示）.1试验部分 1.1仪器本试验所用仪器信息如表 1 所列.1.2原料与试剂诃子购自西宁市八一药材市场，由青海民族大学热增才旦教授鉴定为使君子科植物诃子（Terminalia chebula Retz.）的成熟干燥果实.高效液相色谱（HPLC）中所用甲醇、乙腈、乙酸均为色谱纯（武汉弗顿控股有限公司），水为实验室自制超纯水，其余试剂为分析纯.1.3方法 1.3.1样品制备取诃子果实 10 kg，粉碎，60%乙醇溶液为提取溶剂，料液比 110，超声提取 1 h，过滤，滤液浓缩后冷冻干燥，得到粗提物.注入粗提物水溶液于D101 大孔吸附树脂层析柱（20 cm160 cm），静置吸附 24 h 后，先用大量 30%乙醇溶液洗脱，边洗脱边用 HPLC 检测，直至洗脱液中无化合物，再用 50%乙醇溶液洗脱，制备液相色谱对 50%乙醇洗脱部位分离，得到诃黎勒酸标准样品.样品经 HPLC 分析，色谱柱：Agela Innoval C18（250 mm4.6 mm,5 m）.流动相：甲醇0.5%乙酸水溶液.洗脱程序：030 min，45%80%甲醇.流速：1.0 mL/min.柱温：30.检测波长：274 nm.运行时间：30 min.OOOHOHOHHHOOOO123456OHHOHOHOOHHOOOHOHOHOOHOOCOOHOHHH123456172345671234567HO12345671234576图 1诃黎勒酸的化学结构Fig.1Chemical structure of chebulagic acid第 2 期宋志博，等：藏药诃子质量标志物诃黎勒酸的标准化分析研究141制备液相分离条件，色谱柱：Reprosil 100 C18（250 mm20 mm,10 m）.流动相：甲醇水（体积比为 4555）.流速：18 mL/min.检测波长：281 nm.1.3.2纯度分析（1）薄层色谱分析.采用乙酸乙酯甲醇三氟乙酸（体积比为 510.01）和丙酮甲醇三氟乙酸（体积比为 41.250.01）两种展开体系进行检测分析，GF254 硅胶板，梯度点样.（2）HPLC 分析.色谱柱：Agela Innoval C18（250mm4.6 mm,5 m）.流动相：乙腈0.5%乙酸水溶液（体积比为 1486）.流速：1.0 mL/min.柱温：30.检测波长：200400 nm.运行时间:30 min.（3）液相色谱-质谱（LC-MS）分析.色谱柱：Agela Innoval C18（250 mm4.6 mm,5 m）.流动相：乙腈0.5%乙酸水溶液（体积比为 1090）.流速：1.0 mL/min.运行时间:30 min.柱温：30.MS 条件：电喷雾离子源（ESI）.毛细管电压 4.0 kV.载气：N2.载气流速:10 L/min.载气温度：550.扫描范围：m/z 为 501 500.1.3.3水分和灰分含量测定依据 GB 606