布鲁菌S2疫苗株GL_0002189基因原核表达及生物信息学分析.pdf

科学研究|组稿 Email：n mg x my 2 0 0 8 s i n a.c o m布鲁菌 S2 疫苗株 GL_0002189 基因原核表达及生物信息学分析王文龙1,红梅,呼和巴特尔1*（1.内蒙古农业大学兽医学院，农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特0 10 0 18；2.内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特0 10 0 10)摘要：为区分羊种布鲁菌S2疫苗株为疫苗免疫还是自然感染，本课题组对布鲁菌S2疫苗株进行了测序，将测序得到的基因与已在NCBI数据库中提交的布鲁菌基因组进行比对,找出了布鲁菌S2(猪种)疫苗株特有的GL_0002189基因，再对GL_0002189基因进行克隆、表达及验证，并采用布鲁菌BP26基因当作阳性对照。同时对GL_0002189基因进行了生物信息学分析。结果发现，以绵羊S2疫苗免疫的血清当作抗体检测，重组蛋白BL21(pETBP26)、BL2 1(p E T G L_0 0 0 2 18 9)与空菌BL21(DE3)比较，分别在32 kDa和2 9kDa处出现条带。结果表明重组蛋白BL21(pETBP26)、BL2 1(p E T G L_0 0 0 2 18 9)能够与布鲁菌S2免疫血清中的抗体特异性结合,且具有很好的免疫原性。另外,重组蛋白BP26与自然感染的血清发生特异性反应，而重组蛋白GL_0002189与自然感染的血清不发生特异性反应，因此GL_0002189基因在布鲁菌S2疫苗株中存在，而在羊种布鲁菌自然流行株中不存在。通过生物信息学分析发现,GL_0002189基因编码蛋白分子量约为2 4.1kDa，含有1个6 6 0 bp的完整的开放阅读框，编码2 19个氨基酸，无跨膜区，有5个抗原表位。由此表明，本研究中的GL_0002189抗原可用于布鲁菌S2疫苗免疫与羊种布鲁菌自然感染的鉴别诊断，为布鲁菌病的诊断提供了理论支持。关键词：布鲁氏菌;GL_0002189基因；原核表达；鉴别诊断中图分类号：S852.61布鲁菌病是一种由属于布鲁菌属的微生物引起的细菌性人畜共患病,布鲁菌进人体后，约有9 0%的菌被中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞杀死,然而少部分细菌会在巨噬细胞内寄生,并扩散到细胞和组织中-2。自2 0 世纪8 0 年代末以来，布鲁菌病在部分国家和地区快速流行，感染了6 0 多种野生动物，并对畜牧业造成了巨大的经济损害3。人类很容易通过动物及其产品感染布鲁菌病。即使人类不是这种疾病的携带者，但感染布鲁菌可导致生殖能力丧失，也可导致孕妇流产。1材料与方法1.1材 料布鲁菌S2疫苗株为金宇保灵生物药品有限公司生产;E.coliBL21(DE3)和E.coliDH5a购自全式金生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的驴抗绵羊IgG购自依托生物有限公司；布鲁菌自然感染的血基金项目：内蒙古自治区科技计划项目(2 0 150 2 0 7 1)作者简介：王文龙（197 6 一），男，博士，教授，博士生导师，研究方向为人兽共患病及其防治。红梅（198 8 一）,女，博士，助理研究员，研究方向为生物化学与分子生物学。通讯作者：呼和巴特尔（196 6 一），男，硕士，教授，博士生导师，研究方向为人兽共患病及其防治。文献标识码：A文章顺序编号：10 0 5-5959(2 0 2 3)0 3-0 17-0 6清S2疫苗免疫的血清均为内蒙古自治区巴彦淖尔市自繁自养羊场采集。DNA提取试剂盒、pMD19-T Simple Vector、PCR产物回收试剂盒、DNAMarker、T 4连接酶、蛋白质Marker及限制性内切酶Xhol和EcoRI均购自宝生物生物制品有限公司。从测序得到的S2序列中找出GL_0002189基因序列,设计引物并分别插人EcoRI、X h o I 酶切位点，同时用BP26基因（布鲁菌外膜蛋白基因)作为对照组。引物序列如下,GL_0002189基因引物：上游引物序列为5-GCCGGGAATTCTTGTACGGTTTACTGAACAC-3,下游引物序列为5-TGTCTCGAGTCAAGGCTGTTGGATTCGCA-3;BP26基因引物：上游引物序列为5-GCGAATTCATGAACACTCGTGCT-3，下游引物序列为 5-GCCTCGAGTTACTTGATTTCAA-3。1.2方法1.2.1布鲁菌S2疫苗株特有基因的验证。将布鲁菌S2疫苗株的GL_0002189基因序列与NCBI数据库提交的布鲁菌几种序列进行比对分析，并进行PCR扩增及验证。1.2.2布鲁菌目的基因的扩增、克隆及测序。取目的基因PCR产物2 5L进行1%凝胶琼脂糖电泳检测，并将PCR产物纯化。将PCR纯化的产物与pMD19-T202303当代畜禽养殖业17组稿VEmail：n m g x m y 2 0 0 8 s in a.c o m|科学研究载体连接过夜，连接温度为16，再转化到E.coliDH5a中，并涂布于含卡那霉素抗性的大肠杆菌培养基上培养过夜,培养温度为37。从板上挑取单菌落摇菌过夜，摇菌温度为37，再进行提取质粒及双酶切鉴定。1.2.3表达载体的构建。首先将从测序正确的菌株提取目的基因质粒,并将表达载体pET30a(+)和目的基因均以限制性内切酶XholI和EcoRI进行双酶切,将表达载体片段和目的基因片段进行回收，并对载体片段和目的片段使用T4连接酶过夜连接，连接温度为16,将连接产物转人到感受态BL21(DE3)细胞中，涂于含卡那霉素抗性LB培养基上过夜培养，培养温度为37；从培养好的平板上用牙签挑取单菌落进行鉴定，再挑取鉴定结果均为阳性的菌株进行测序。1.2.4表达产物检测。SDS-PAGE检测对重组蛋白进行诱导表达，再对诱导的菌液进行离心，取沉淀悬于Ni+柱结合缓冲液（washing/bindingbuffer），并置于-2 0 冰箱中反复冻融3 5次,加人溶菌酶(10 mg/mL)至终浓度为1mg/mL，室温放置1h后超声破碎细菌，离心收集沉淀和上清，再用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况。布鲁菌S2免疫血清的制备。本试验在内蒙古自治区巴彦尔市自繁自养羊场进行。选择2 年内均未进行疫苗免疫并且试管凝集试验(SAT)和虎红平板试验(RBT)检测均为阴性的羊,进行布鲁菌 S2 疫苗免疫。在免疫后第2 0 天进行采血，并进行分离血清。以RBT、SA T 及cELISA3种方法检测结果均显示阳菌株种属Brucella suis bv.1 str.S2猪种(B.suis)Brucella melitensis M5-90羊种（B.melitensis)Brucella abortus bv.1 str.941牛种(B.abortus)Brucella ovis ATCC 25840绵羊种（B.ovis)Brucella canis strain RM6/66犬种(B.cains)Brucella microti cCM 4915鼠种（B.microti)注：“+表示有；“-表示无”。经PCR扩增发现只在猪种布鲁菌的DNA中扩增出了约6 6 0 bp大小的条带，而在牛种和羊种布鲁菌的DNA中均无扩增出特异性条带（图1)。2.2目的基因扩增对BP26基因和GL_0002189基因进行PCR扩增后,采用1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果分别扩增出约6 6 0 bp和7 53bp条带,并且与预期目的条带大小一致(图2)。18当代畜禽养殖业202303性的血清判定为布鲁菌S2疫苗免疫血清。cELISA试验结束后，根据OD45o值计算出每组PI(抑制率)值：PI=(100-样本平均0 D450值10 0)/空白对照组平均OD450 值。自然感染血清的制备。在内蒙古自治区巴彦淖尔市自繁自养羊场选择2 年内未接种过布鲁菌疫苗且SAT和RBT检测均为阳性的羊，进一步进行cELISA检测，,如果以上结果均为阳性,则确定为布鲁菌自然感染的羊,最后采用AMOS-PCR鉴定所感染的菌种 5。将诱导表达的产物经SDS-PAGE电泳分离后，再转移到NC膜上进行了免疫印记。HRP标记的免抗羊IgG当作二抗，羊布鲁菌S2免疫的血清当作一抗。采用生物信息学分析法对布鲁菌S2疫苗株全基因组测序预测得到的GL_0002189基因的编码序列进行了分析。使用DNAstar中的EditSeq软件分析S2疫苗株氨基酸序列特征。经http:/www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html在线数据库分析蛋白质的跨膜区；经 http:/www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/数据库预测抗原表位；再经https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html数据库分析蛋白质的二级结构。2结果与分析2.1特有基因验证布鲁菌 S2疫苗的 GL_0002189基因序列与NCBI数据库提交的6 种布鲁菌的基因序列进行了比对分析,发现特有基因GL_0002189的序列只有在犬种、猪种及鼠种布鲁菌中存在，而牛种、绵羊种及羊种中均不存在(表 1)。表1GL_0002189基因序列比对结果2.3目的基因双酶切鉴定将经PCR鉴定出阳性的菌株进行质粒提取，再用限制性内切酶(XhoI、E c o R I)进行双酶切,然后对酶切产物进行电泳检测。结果发现，均扩增出了大小不一致2 个条带，分别为BP26（0.7 k b 和5.4kb)及GL_0002189(0.7kb和5.4kb)。由此表明，目的片段成功插人表达载体pET30a中（图3、图4）。GL_0002189+同源性/%1000009999科学研究|组稿VEmail：n mg x my 2 0 0 8 s i n a.c o mM12000bp1000bp一750bp一500bp-250bp_100bpM:DL2000bpDNAmarker;1:S2疫苗株;2:羊种布鲁菌；3：牛种布鲁菌图1特有基因PCR验证结果M1232000bp1900bP750bP=500bP2506P=100bpM:DL 2 000 bp DNA marker;1:GL0002181;2:BP26图2 GL_0002189基因及BP26基因扩增琼脂糖凝胶电泳图15.888.6号7508bP50006P2000bp2500bP1.900bP二750bP二500bP一2506P=100bpM1:DL2000bpDNAmarker;M2:DL15000bpDNA marker;13:GL_0002189 基因图3重组克隆质粒GL_0002189双酶切M123M16.88.B7500bp2.000bp25006p1900bP二1000bp750bP一508P2品=100bpM1:DL 2 000 bp DNA marker;M2:DL 15 000 bpDNA marker;13:BP26 基因图4重组克隆质粒BP26双酶切2.4核苷酸序列测定及分析经双酶切和PCR鉴定均为阳性的菌液进行了双2M123M-1000bp250bp250bp3向测序。将全基因组测序得到的GL_0002189基因核苷酸序列与双向测序得到的GL_0002189基因序列进行比对,结果发现同源性为10 0%;将双向测序得到的BP26基因（登录号U45996)序列与NCBI数据库提交的序列同源性为10 0%。上述结果表明,BP26和GL_0002189成功克隆至载体pMD19-T中,且成功构建了重组表达载体。GL_0002189基因序列如下:TTGTACGGTTTACTGAACACGCTACGCGATCTCGATGCCCGCACGCTCATGCTGGCGCTGGCCGAGGTCGTTGCGACTACAGGCGATCTGCGGGCCAGGGTCAATCCTAAGTATCGGTTCGATGAGCGATTGCACGACCTGACGCAGTGCCTACTGCTGGACGGCTACATCATCAAGAGCAAGAT