不同温度对柔嫩艾美耳球虫卵囊活力的影响.pdf

不同温度对柔嫩艾美耳球虫卵囊活力的影响林栩慧1#，朱易斌1#，郭素茵3，戚南山1，郭钊文3，李娟1，严专强2，尹丽娟2，李汝洪3，刘佐正4，吕敏娜1，廖申权1，2*，孙铭飞1*（1.广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室，广东 广州，510640；2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室云浮分中心，广东 云浮 527400；3.清远市清城区动物防疫中心，广东 清远 511500；4.河源市温氏畜禽有限公司，广东 河源 517000）摘 要：环境温度是影响鸡球虫卵囊孢子化和活力的重要因素，该研究通过监测鸡球虫卵囊孢子化率、鸡感染球虫后的肠道病变以及卵囊排出情况，探讨不同温度对柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊的孢子化作用以及对孢子化卵囊的活性影响。结果表明：未孢子化卵囊分别经过-80 处理30 min，-40、-20、0、4、10、28、40、50 处理30 min或1 h后，孢子化活性均无显著变化；未孢子化卵囊分别经过-80 处理1 h以上、-40 或-20 处理48 h以上、60 处理30 min以上后孢子化活性被抑制；孢子化卵囊经液氮处理2 min、-80 或高于50 条件处理超过1 h，卵囊活力基本为0，在-20 处理112 h或50 处理30 min卵囊仍表现有一定活力。该研究为鸡球虫卵囊保存条件提供数据支持，对防治鸡球虫病具有一定的研究意义。关键词：柔嫩艾美耳球虫；不同温度；卵囊活力中图分类号：S852.7文献标识码：A文章编码：10058567（2023）04001307Effects of Different Temperatures on Viability andSporulation of Oocysts from Eimeria TenellaLIN Xuhui1#，ZHU Yibin1#，GUO Suyin3，QI Nanshan1，GUO Zhaowen3，LI Juan1，YAN Zhuanqiang2，YINLijuan2，LI Ruhong3，LIU Zuozheng4，LV Minna1，LIAO Shenquan1，2*，SUN Mingfei1*（1.Key Laboratory of Livestock Disease Prevention of Guangdong Province，Scientific Observation and ExperimentStation of Veterinary Drugs and Diagnostic Techniques of Guangdong Province，Key Laboratory of Avian Influenza andOther Major Poultry Diseases Prevention and Control，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Institute of AnimalHealth，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou Guangdong 510640；2.Yunfu Branch Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture，Yunfu Guangdong 527400；收稿日期：20230721基金项目：“十四五”广东省农业科技创新十大主攻方向“揭榜挂帅”项目（NO.2022SDZG02）；广东省农业科学院协同创新中心项目（XTXM202202）；科技创新战略专项资金（高水平农科院建设）（202110TD，202122TD，R2020PYJC001，R2019YJYB3010，R2020PYJG013，R2020QD048，R2021PYQY007，R2023PYJG018）；广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项（2022KJ119）表示并列第一作者作者简介：林栩慧（1988年生），男，副研究员，研究方向：寄生生物学。Email：；朱易斌（1998年生），男，硕士研究生，研究方向：顶复门原虫分子生物学研究。Email:*通讯作者：廖申权（1981年生），女，研究员，研究方向：寄生虫代谢组学研究。Email：；孙铭飞（1978年生），男，研究员。研究方向：寄生虫入侵机制研究及靶向药物开发。Email：Guangdong Journal of Animal And Veterinary ScienceDOI:10.19978/ki.xmsy.2023.04.03广东畜牧兽医科技广东畜牧兽医科技2023年（第48卷）第4期试验研究 13试验研究不同温度对柔嫩艾美耳球虫卵囊活力的影响林栩慧，等鸡球虫病是一种由艾美耳球虫引起的寄生性原虫病12。据不完全统计，全球每年因鸡球虫病引起的经济损失高达30亿美元，我国每年因球虫引起的经济损失达35亿人民币，给全世界养鸡业造成了重大危害35。目前，鸡球虫病的防控主要通过药物防控和疫苗防控为主，在鸡球虫病的发生和流行中，温度和湿度具有重要的影响作用，甚至关系到疫苗免疫的成败67。鸡球虫病是鸡通过经口方式感染孢子化球虫卵囊而引起的疾病。由此可知，鸡球虫病的发生与环境中球虫卵囊的孢子化率以及孢子化球虫卵囊的活力状态有着直接的影响。本研究旨在探讨不同温度处理不同时间对鸡球虫卵囊活力的影响，以期为球虫环境消杀及活卵囊保存做出临床指导。1材料与方法1.1材料1.1.1试验仪器：恒温水浴锅、-80 冰箱、-40 冰箱、-20 冰箱、制冰机、光学显微镜、恒温水浴振荡器、低速大容量离心机、麦克马斯特计数板、计数器、血球计数板、试管。1.1.2试验试剂：饱和盐水、无球虫去离子水、2.5%重铬酸钾、液氮、PBS。1.1.3试验动物：1日龄818快大肉杂母鸡，购自温氏簕竹种鸡场，用55 高温过夜处理后的小鸡料进行饲喂。饲养笼具及水槽料槽均火焰消毒或沸水消毒处理。1.1.4试验虫株：柔嫩艾美耳球虫ETGD株，由广东省农业科学院动物卫生研究所寄生生物学实验室分离、保存。1.2方法1.2.1ETGD株的扩繁对实验室保存的ETGD株进行离心去除重铬酸钾保存液，用PBS进行混悬计数，在无球虫环境下经口饲喂12日龄无球虫感染雏鸡20只，每只感染1万个孢子化卵囊。感染7天后进行肠道和粪便中卵囊的回收，2.5%重铬酸钾保存。收集的未孢子化卵囊一部分放置 28 水域摇床中孢子化处理，一部分未孢子化卵囊计数为每毫升 10 万保存，备用。1.2.2不同温度处理不同时间对未孢子化卵囊的影响对刚复壮收集的未孢子化卵囊进行计数分组，每组添加10万卵囊液置于试管中，以不同温度（-80、-40、-20、0、4、10、28、40、50、60、70、100）不同时间（30 min、1 h、24 h、48 h、96 h）分别对ETGD株未孢子化卵囊进行处理，对不同温度处理不同时间后的卵囊放置28 水浴摇床进行孢子化，在24 h、48 h和96 h后进行光学显微镜镜检，观察孢子化情况（方案见表1）。各处理组依次取样点载玻片，盖上盖玻片进行ETGD株孢子化卵囊的形态学监测，每次随机计算100个卵囊得出孢子化卵囊数，每组重复计算3次取平均值，并计算出孢子化率。3.Qingcheng district animal epidemic prevention center，Qingyuan Guangdong 511500；4.Wens Livestock and Poultry Co.，Ltd.，Heyuan Guangdong 517000）Abstract：Temperature is an important factor affecting the sporulation and viability of avian coccidia oocysts.Inthis study，the effects of different temperatures on the sporulation of Eimeria tenella unsporulated oocysts and theviability of sporulated oocysts were investigated by monitoring the sporulation rate of avian coccidia oocysts，intestinallesions and oocyst production.The results showed that there was no significant change in the oocyst sporulation activitycompared to be treated at-80 for 30 min，and at-40，-20，0，4，10，28，40，50 for 30min or 1 h respectively，but the oocyst sporulation activity was inhibited after administrated at-80 for more than 1h，-40 or-20 for more than 48 h，and 60 for more than 30 min.The sporulated oocysts were killed byexposure to liquid nitrogen for 2 min，or at-80 or higher than 50 for more than 1 h，whereas sporulated oocystsremain viable at-20 for 1 to 12 h or at 50 for 30 min.This study provides data support for the storage conditionsof avian coccidia oocysts，and has certain research significance for the prevention and treatment of avian coccidiosis.Keywords：Eimeria tenella；Temperature；Vitality；Sporulation 14不同温度对柔嫩艾美耳球虫卵囊活力的影响林栩慧，等试验研究孢子化率=孢子化卵囊/（孢子化卵囊+未孢子化卵囊）*100%1.2.3不同温度处理不同时间对孢子化卵囊的影响对不同温度处理不同时间的孢子化卵囊进行攻虫动物试验，每个处理组感染 9 日龄 818 肉杂鸡5只，每只鸡攻虫10万个孢子化卵囊。感染后第5天观察血便情况，感染后第7天，统一杀鸡，剖检肠道，查看盲肠病变情况，同时收集感染后第57天的混合粪便进行克粪便卵囊计数（OPG）。观察各组鸡只感染球虫后第57天的临床症状，包括试验鸡的精神状态、食欲量、粪便情况、死亡情况。试验过程中若出现死鸡，及时剖检观察病变是否由球虫感染引起。若观察到死鸡盲肠出血肿大或出现干酪样坏死且盲肠内容物镜检出大量球虫卵囊，则判为球虫致死。感染后第 7 天宰杀鸡，参照 Johnson 和 Reid（1970）设计的病变记分法进行每只鸡的肠道病变记分，并换算成病变值8。1.2.3.1血便记分标准接种卵囊后第5天，按以下标准记分。分：100%粪便不带血；1分：1%25%粪便带血；2分：26%50%粪便带血；3分：51%75%粪便带血；4分：76%100%粪便带血。1.2.3.2肠道病变记分标准：（两侧盲肠病变不一致时，以严重的一侧为准）0分，无肉眼病变；1分，盲肠壁有很少量散在的瘀点，肠壁不增厚，内容物正常；2分，病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚，内容物正常；3分，盲肠内有多量血液或有盲肠芯（血凝块或灰白色干酪样的香蕉型块状物），盲肠壁肥厚明显，盲肠