不同生境黑老虎根际和内生真菌多样性分析.pdf

.():/.:./.刘涛 马楠 金吉芬 等.不同生境黑老虎根际和内生真菌多样性分析.广西植物():.():.不同生境黑老虎根际和内生真菌多样性分析刘 涛 马 楠 金吉芬 彭志军 李兴忠 汪得凯(.贵州省果树科学研究所 贵阳 .浙江理工大学 生命科学与医药学院杭州 .贵州省农作物品种资源研究所 贵阳 )摘 要:为探究不同生长条件下黑老虎根际和根部内生真菌群落组成和多样性及其与土壤环境因子的相关性该文应用 高通量测序方法对贵州 个不同生境下黑老虎根际和根部内生真菌进行了研究 结果表明:()种生境下根际土壤真菌 数量()远多于根部内生真菌()其中根际土壤真菌共有的 为 个共注释到 个门、个属大多为子囊菌门属水平上被孢霉属、外瓶柄霉属、柱孢属占比较高根部内生真菌共有的 为 个共注释到 个门、个属子囊菌门(个占比.)占绝对优势属水平上被孢霉属、外瓶柄霉属、柱孢属和丛赤壳属占比最高 所有样本中共有的 仅为 个注释到 个门、个属子囊菌门(个占比.)为优势门在属水平上占比最高的为外瓶柄霉属(个.)其余分别为被孢霉属、柱孢属和丛赤壳属 多样性分析表明根际土壤的真菌群落多样性和丰富度均显著高于根部内生真菌而野生生境的真菌多样性高于栽培生境()在门水平上 个生境下主要内生真菌类群均为子囊菌门()和担子菌门()占总菌群的.在属水平上不同生境条件下根际和根部内生真菌群落结构差异明显栽培生境下根部内生真菌菌群具有一定的偏好性而野生生境下根部内生真菌菌群均匀度更高 真菌群落功能预测显示栽培生境下的病理腐生营养型()在根部内生真菌中占比较高而野生生境下的腐生营养型()及共生营养型()占比较高()土壤环境因子对根部内生真菌和根际真菌的影响方式不同其中土壤总钾()和土壤总磷()与黑老虎根部内生真菌香农指数和辛普森指数显著正相关而土壤有机质()、总氮()和速效氮()与黑老虎根际土壤真菌 指数和 指数显著正相关 综上表明、是影响黑老虎根际土壤真菌群落的主要土壤环境因子关键词:黑老虎 高通量测序 真菌群落 土壤环境因子 多样性中图分类号:文献标识码:文章编号:()收稿日期:基金项目:浙江省重点研发项目()浙江理工大学科研启动基金()第一作者:刘涛()硕士副研究员研究方向为果树栽培育种().通信作者:汪得凯博士研究员研究方向为药用植物资源().(.):.:()()().(.).(.).(.).().().()().()()().:黑 老 虎()隶 属 五 味 子 科()南五味子属()其果实富含多种氨基酸、维生素、粗蛋白质、可溶性糖等营养成分是一种历史悠久的民间药材植物 近年来黑老虎因丰富的营养和独特的风味而深受消费者的欢迎在贵州黔东南、湖北恩施及湖南通道等南方地区作为一种新型特色水果成为脱贫致富的林下产业(刘涛等高渐飞等)黑老虎在医药、保健食品及食品领域展现出广阔的应用前景(.王丽军等)植物宿主与内生真菌、根际土壤真菌交互作用形成复杂的调控网络共同维持生态系统的动态平衡(.)植物内生真菌生活在宿主体内不会引起宿主明显病症与宿主协同进化利用宿主营养供自身需要同时在植物生长发育、增强逆境抵抗能力和生物系统演化等方面发挥重要作用(.)此外内生真菌在与宿主的长期相互作用中通过影响和调节宿主次生代谢产物的合成及累积影响宿主活性物质的分布和含量或可以产生与宿主植物类似的次生代谢物广泛应用于农学、医学、工业和生物技术等领域()根际真菌一方面利用植物中的碳水化合物进行生长发育在有机质转化、碳氮循环和促进土壤环境 期刘涛等:不同生境黑老虎根际和内生真菌多样性分析健康等方面发挥重要作用另一方面其自身新陈代谢所产生的产物反过来可以促进或抑制植物的生长()而同为木兰科的五味子内生真菌研究有一些报道五味子属植物中含有丰富的内生真菌从不同来源、不同组织中分离的内生菌具有抗氧化、拮抗植物病原 菌 等 功 能(潘 争 艳 等 .张誉荠等)此外从五味子中陆续分离的一些内生真菌能够产生与宿主植物类似的木脂素及三萜类或具有转化宿主次生代谢物的功能(.)刘涛等()利用高通量测序技术对黑老虎不同组织内生真菌进行了分析明确了不同组织内生真菌群落的结构和功能特征 植物内生真菌和根际真菌群落组成和结构受物种、地理环境、气候和土壤特性等多种因素影响(.王艳等)目前对黑老虎及南五味子属的研究多集中于营养成分和药理学研究而对黑老虎根际真菌和内生真菌组成和多样性研究尚不多见本研究采用 高通量测序技术研究了栽培和野生生境下多年生成熟黑老虎根际真菌和根部内生真菌群落结构、组成和多样性并开展了真菌多样性和土壤理化因子的相关性分析以期为黑老虎资源保护、土壤根际微生态环境研究及有益微生物的发掘和利用提供基础材料与方法.采样地点及样品处理选取贵州省 个黑老虎代表性研究样地(个样地)贵阳()样地贵阳市贵州果树研究所黑老虎种质资源圃(.、.)海拔 为多年生人工管理种质资源圃土壤类型为中厚层红黄壤榕江()样地黔东南苗族侗族自治州榕江县古州镇(.、.)海拔 为野生样地土壤类型为中厚层红黄壤为主富含有机质福泉()样地 黔 南 布 依 族 苗 族 自 治 州 福 泉 市 金 山 街 道(.、.)海拔 为野生样地土壤类型以石灰石为主富含 福泉有“亚洲磷都”之美誉 个样地分别代表不同栽培生境、不同土壤类型和不同酸碱度代表了贵州黑老虎生长的主要生境于果实采收季节分别在 个样地选取生长多年、藤蔓高度木质化的健康植株用铲子去除地表植被和杂质使用小锄头轻轻刨开土壤寻找主根周边的细根(直径)挖取少量带土的细根(.)每 株样品合并为 个生物学重复每个样本设置 个生物学重复将样品收集至无菌采样袋中并密封保存迅速置于冷链箱内于 内带回实验室处理将黑老虎根部的土壤抖落留存附着在根部无 法 抖 落 的 为 根 际 土()(.)将根系样品转移至无菌 离心管中(含 无菌 溶液)置于摇床(苏州培英实验设备有限公司培英型号:)室温下振荡(.)使用无菌镊子挑除根系剩余悬浮液高速离心()沉淀即为根际土样品液氮速冻后置于 冰箱备用 剩余的根系样品()用自来水冲去表面多余的根际土进行表面消毒(乙醇浸泡 次氯酸处理 无菌水清洗 次)获得表面消毒的根组织样品液氮速冻后置于 冰箱用于 提取.土壤理化指标测定土壤 值测定:称取 土壤样品于 烧杯中加入.去除 的蒸馏水(水土比.)用水平振荡器剧烈振荡 使土粒充分分散后放置 后用 计测定 内完成测定每个样品测定 次计算平均值 土壤总氮()采用半微量凯氏定氮法总磷()采用 碱熔钼锑抗分光光度法土壤总钾()测定采用 熔融法土壤速效氮()的测定采用碱解扩散法土壤速效磷()的测定采用分光光度法土壤速效钾()的测定采用乙酸铵浸提法土壤有机质()的测定采用重铬酸钾容量法 每个样品重复 次.提取及高通量测序根系样品 提取采用植物基因组 提取试剂盒(货号:天根生化科技有限公司北京)根际土壤样品 提取采用土壤 提取试剂盒(货号:天根生化科技有限公广 西 植 物 卷司北京)引物:()和()反应体系():.正、反向引物()各.().反应条件:/(/)个循环 /产物经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 确 证 用 ()纯化()定量 扩增子文库的大小 和 数 量 分 别 用 生 物 分 析 仪()和 ()文库定量试剂盒进行评估 高通量测序委托杭州联川生物技术有限公司完成所用平台为高通量二代测序仪()测序原始数据已提交至 数据库(项 目 号 为 样 品 编 号 为).数据处理及分析高通量测序获得的下机数据根据 拆分后去除 和接头序列并进行质控、过滤得到 使用(.)软件对 进行拼接合并获得原始 用 筛选 的序列 利用(.)去除嵌合体获得最终有效数据用于进一步分析 样本的 多样性指数采用(:/./)软件计算 应用 软 件(.:/./)对有效数据序列在 的相似度下进行()聚 类 采 用 进行 物种注释分析获得样品 的分类学信息 韦恩图、分析、分析等利 用 联 川 云 平 台(:/./)进行 利用 软件对真菌进行功能预测分析(.)采用 对土壤理化性质进行显著性差异分析结果与分析.个样地黑老虎根际土壤理化特性由表 可知 个不同生境下黑老虎根际土壤的理化指标存在显著差异野生生境土壤主要养分指标高于栽培生境 个生境中贵阳栽培生表 个样地黑老虎根际土壤理化特性 理化指标 贵阳榕江福泉酸碱度.总氮().总磷().总钾().速效氮().速效钾().速效磷().有机质().注:不同小写字母表示在.水平上存在显著差异:(.).境(.)和 榕 江 野 生 生 境(.)下的根际土壤为酸性(个)(个)共有的 为 个 共有的 共注释到 个门绝大多数为子囊菌门(个占比.)共注释到 个属占比前几位的有未分类属(个.)、被孢霉属(个.)外瓶柄霉属、柱孢属、丛赤壳属和隐球菌属均为 个各占比.根部内生真菌中各地区 数从多到少依次为()()()共有的 为 个 个共有的 共注释到 个门子囊菌门有 个占比.共注释到 个属占比最高的为外瓶柄霉属(个.)其余属均为 个各占比.根际土壤真菌和内生真菌所有样品共有的 仅为 个注释到 个门子囊菌门为 个占比.注释到 个属占比最高的为外瓶霉属(个.)其余分别为被孢霉属、柱孢属和丛赤壳属(图)图 结果显示 个样地样品中真菌 数量均为根际土壤根内野生样地 多样性较高 共有的 中被孢霉属、外瓶柄霉属、柱孢属和丛赤壳属最为常见.黑老虎根际土壤真菌和根部内生真菌多样性 多样性分析表明 种生境下根际土壤的真菌群落多样性和丰富度均显著高于根部内生真菌 个 样 地 根 际 土 壤 真 菌 中 香 农 指 数()和辛普森指数()无显著差异 中 指数和 指数显著高于 和 个样地根部内生真菌中 香农指数显著高于 和 辛普森指数显著低于 和 而 的 指数和 指数显著低于 与 无显著差异(表)这说明了 个生境根际土壤真菌多样性和优势度无显著差异 的根际真菌群落丰度高于其余两地 个样地根部内生真菌中 的真菌群落多样性显著高于其他两地 栽培生境的真菌优势度显著低于两个野生生境(和)通过无权重距 离 矩 阵()算法对 个样地样品进行主坐标分析()分析结果显示主坐标 和主坐标 分别解释了.和.的多样性合计解释了.的多样性 个生境下的根部内生真菌群落聚集于第二、第三象限根际土壤真菌群落聚集于第一、第四象限显示 个不同生境中根际土壤真菌更为相似而根部内生真菌群落更为相似(图)结果表明黑老虎根部内生真菌受地域影响较 小 具 有 明 显 的 种 属 特 异 性 另 外 从 结果可以看出同一类样本的 个生物重复均能很好地聚在一起说明本研究所采用的样本重复性好数据可靠性高.黑老虎根际土壤和根部内生真菌组成和结构 个生境下共 个黑老虎根际土壤和根样品中共检测到了真菌 个门依次为(个)、(个)和(个)个样地相差不大 个样地 组 样 品 中 真 菌 优 势 类 群 均 为 子 囊 菌 门()和担子菌门()其中子囊菌门占比最高 占比范围.在栽 培 生 境()的 根 内()占 比 高 达.而在栽培生境的根际土壤()中占比最 低(.)和 中 存 在.和.的未分类真菌(图:)在属水平上共注释到 个属 个生境中注释到的真菌属依次为()()()个生境下优势属的结构和丰度存在明显差异根部内生真菌中栽培生境()下外瓶霉属(.)优势明显其他属占比均不超过 个野生生境下 的优势菌群为(.)、黄 丝 菌 属(.)和 (.)的优势菌群为蜡壳耳目未分类属(.)、外瓶霉属(.)和球囊菌门未分类属(.)个样地的根际土壤真菌被孢霉属()占比均最高分别为.()、.()和.()此外 优势菌群还有癣囊腔 菌 属(.)和 外 瓶 霉属(.)中优势菌群为新丛赤壳属广 西 植 物 卷图 黑老虎根际土壤和根部内生真菌的 稀释曲线.()()(.)中优势菌群为癣囊腔菌属(.)和柱孢属(.)(图:)结果显示栽培生境下根部内生真菌菌群具有一定的偏好性部分菌群具有优越性而野生生境下菌群均匀度更高以相对丰度 的属制作的热图显示 个生境下根部内生真菌和根际真菌群落均存在显著差异其中根际土壤真 菌 群 落 聚 为 一 类与 聚类图结果一致表明黑老虎根际土壤真菌群落结构受生境影响较小黑老