病程相关蛋白基因GmPR1-6的克隆及其在大豆抵抗SMV侵染过程中的功能初探.pdf

第 46 卷第 4 期2023 年 7 月河 北 农 业 大 学 学 报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.46 No.4Jul.2 0 2 3病程相关蛋白基因 GmPR1-6 的克隆及其在大豆 抵抗 SMV 侵染过程中的功能初探苏伟华，赵志华，齐梦楠，孙天杰，王冬梅，张 洁（华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省植物生理与分子病理学重点实验室/河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071000）摘要：为了探究大豆抵抗大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）侵染的分子调控机制，挖掘抗病相关基因，培育抗病新品种，本研究从清除 H2O2前后大豆响应 SMV 的转录组数据库中筛选得到 1 个差异表达的大豆病程相关蛋白基因 GmPR1-6（Glyma.15G062400.1），利用生物信息学分析并结合实时荧光定量（Real time quantitative,RT-qPCR）技术以及病毒介导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）等技术验证其在大豆抵抗 SMV 侵染过程中的功能。结果表明，GmPR1-6 在非亲组合中转录水平的表达量显著高于亲和组合；GmPR1-6 基因沉默植株叶片接种 SMV 的部位胼胝质积累面积增大、胼胝质荧光强度减弱，病毒在胞间扩散的能力增强，说明 GmPR1-6 基因在大豆抵抗 SMV 侵染过程中发挥正调控作用。研究结果为进一步探究病程相关蛋白在大豆抵抗 SMV 侵染过程中的功能提供试验依据。关 键 词：大豆花叶病毒；病程相关蛋白；病毒介导的基因沉默技术（VIGS）；功能分析中图分类号：S643.7 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文献标志码：ACloning and functional analysis of pathogenesis-related protein gene GmPR1-6 in soybean resistance to SMV SUWeihua,ZHAOZhihua,QIMengnan,SUNTianjie,WANGDongmei,ZHANGJie(State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/Key Laboratory of Hebei Province for Plant Physiology and Molecular Pathology/College of Life Sciences,Hebei Agriculture University,Baoding 071001,China)Abstract:It is crucial to investigate the molecular regulatory mechanisms of disease resistance to soybean mosaic virus SMV.It is of great importance for cultivation of disease-resistant soybean varieties to identify genes associated with disease resistance.In this study,a differentially expressed pathogenesis-related proteins gene,GmPR1-6(Glyma.15G062400.1),was screened out from the transcriptome database of soybean treated with H2O2 elimination 收稿日期：2023-03-20基金项目：河北省自然科学基金（C2020204132;C2020301020）；河北省现代农业产业技术体系创新团队建设大豆产业创新团队（326-0702-JSNTKSF）；河北省科技厅现代种业科技创新专项子课题（21326313D-1）.第一作者：苏伟华（1997），女，河北承德人，硕士研究生，主要从事植物逆境分子生物学研究.E-mail:通信作者：张 洁（1974），女，河北冀州人，博士，副教授，主要从事植物逆境分子生物学研究.E-mail:本刊网址：http:/文章编号：1000-1573(2023)04-0008-08DOI：10.13320/ki.jauh.2023.00539第 4 期in response to SMV infection.Analysis and verify the function of The function of GmPR1-6 in soybean resistance to SMV was analyzed using bioinformatics methods,real time quantitative PCR(RT-qPCR)and virus-mediated gene silencing(Virus induced gene silencing,VIGS).The results showed that GmPR1-6 expression was significantly higher in the incompatible combination compared to that in the compatible combination.The area of callose deposition around the SMV inoculation sites was significantly increased and the intensity of callose fluorescence was attenuated in the GmPR1-6 silenced plants after SMV inoculation.Moreover,the intercellular transport of SMV was also enhanced after silencing of the gene,indicating a potential role of GmPR1-6 in plant immunity.The results is a foundation for further exploring the function of pathogenesis related proteins in soybean in resistance to SMV.Keywords:Soybean mosaic virus;pathogenesis related protein;virus induced gene silencing;functional analysisPR10 具有较弱的核糖核苷酸酶活性，能够介导高粱对炭疽菌的抵抗能力10。此外，PR 蛋白在植物抗病毒过程中具有重要作用，如 PR2 的诱导表达能够增强辣椒对黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）的抗性11。PR1 蛋白作为植物系统获得性抗性（SAR）防御信号增强的标志，在植物防御反应中起关键作 用12。小麦中病程相关蛋白 TaPR1 与 TaTLP1 能够发生相互作用提高小麦对叶锈菌的抗性13；分泌型 StPR1 能够抑制病原菌的 Ser/Thr 蛋白激酶AMPK 复合体的磷酸化活性，从而抑制病原菌生长，提高马铃薯对致病疫霉菌的抗性14；棉花中GhMYB36 能够与 GhPR1 的启动结合，激活其表达，提高棉花对黄萎病的抗性15；在大豆中过表达 GmPR1L 能够增强大豆对灰斑病菌的抗性16，GmMAPK4-1 能够诱导 GmPR1-6 上调表达，参与大豆抵抗大豆胞囊线虫的防御反应17，而有关 PR1蛋白在植物与病毒互作中的功能研究鲜有报道。课题组长期致力于大豆与 SMV 互作机制的研究，已证明 H2O2信号分子通过参与调控胼胝质（Callose,-l,3-葡聚糖）在胞间连丝颈区的沉积从而参与非亲和互作过程，并构建了清除 H2O2前后大豆响应 SMV 的高通量转录组数据库18。本研究从转录组数据库中筛选得到 1 个差异表达的基因Glyma.15G062400.1，通过 NCBI 数据库进行序列比对，结果表明该基因为 GmPR1-6。利用病毒介导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）技术沉默 GmPR1-6 基因，通过分析基因沉默植株叶片接种 SMV 后胼胝质的积累水平及病毒的扩散情况，解析该基因在大豆抵抗 SMV 侵染过程中的功能，为深入研究病程相关蛋白在大豆抵御 SMV 侵染的分子机制奠定基础。大豆Glycine max（L.）Merr.是我国重要的粮油经济作物，但因其产能不足，导致供需严重不平衡1。由大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）引起的大豆花叶病毒病是我国大豆主产区普遍发生且破坏性强的重要病害，往往造成大豆叶片卷曲、皱缩、花叶、坏死，致使大豆品质、产量急剧下降，甚至绝收2，且采用物理或化学方法对大豆花叶病毒病进行防治十分困难。因此，深入探讨大豆抵抗SMV侵染的分子机制、挖掘主效抗病基因、培育抗病大豆新品种，对提高大豆的产量和品质，促进农业发展具有重要意义。受病原物侵害后，植物体能够诱导产生并积累一类病程相关蛋白（Pathogenesis related proteins,PRP/PRs），从而增强植物抗病能力3。早在 1970年，PR 蛋白首次在感染烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）的烟草叶片中被检测到，并发现其与过敏性反应（Hypersensitive response,HR）相关4，随后在单子叶和双子叶植物中均被挖掘。根据其生物学功能、蛋白质序列相似性、亲缘关系、酶活性等将其分为 17 个家族，不同家族的 PR 蛋白在植物生长发育过程中发挥不同作用3。大量研究表明 PR 蛋白具有广泛的抗细菌和真菌活性，如番茄中 PR1 能对疫霉菌、白粉病菌和蚕豆单胞锈菌等致病真菌产生抑制作用5；PR2 蛋白属于-1,3-葡聚糖酶，能够催化葡聚糖降解，分解真菌细胞壁，在猕猴桃中过表达 PR2 蛋白增强其对猕猴桃溃疡病菌的抗性6；百合中的 LhSorPR4-2 受水杨酸等植物激素的诱导从而提高百合对灰霉病的抗性7；PR6 作为 1 种蛋白酶抑制剂，在植物抵抗细菌、真菌、线虫或食草性昆虫的过程中发挥作用8。PR9蛋白作为过氧化物酶，能够催化木质素、木栓质的生物合成以加固植物细胞壁进而抵御病原菌9；苏伟华，等：病程相关蛋白基因GmPR1-6的克隆及其在大豆抵抗SMV侵染过程中的功能初探10第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报1 材料与方法1.1 试验材料SMV 毒株 N3、SC8 与大豆品种冀豆号分别组成非亲和组合以及亲和组合。其中，SMV 毒株 N3、SC8 以及大豆品种南农 1138-2由南京农业大学智海剑教授惠赠，冀豆号由河北农林科学院粮油作物研究所张孟臣研究员提供。1.2GmPR1-6的克隆与生物信息学分析使 用 UNlQ-10 柱 式 Trizol 总 RNA 抽 提 试 剂盒（货号：B511321,Sangon）提取冀豆号叶片中的总 RNA，经反转录试剂（货号：RR047,TaKaRa）反转为 cDNA 待用。从在线基因组数据库网站 Phytozome（http:/Phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中提取 GmPR1-6（Glyma.15G062400.1）基因的编码区序列，利用 SnapGene 软件设计特异 引 物（表 1），通 过 PCR（Polymerase chain reaction）扩增其编码区（长度为 495 bp），