表面增强拉曼光谱磁免疫分析研究进展.pdf

第 卷第期光散射学报V o l N o 年月THEJ OUR NA LO FL I GHTS C A T T E R I NGJ u n 文章编号:()表面增强拉曼光谱磁免疫分析研究进展张晨杰,姚建林(苏州大学材料与化学化工学部 苏州 )摘要:基于表面增强拉曼光谱的磁免疫分析(简称S E R S磁免疫)因其可实现样品的快速分离、富集、和无损检测以及具有灵敏度高、精准及快速等优点而备受关注.本文综述了S E R S磁免疫分析基本原理及国内外的研究进展,并介绍了S E R S磁免疫与微流控、侧向流动分析及荧光联用检测技术以解决其在微量快速检测、多组分分析及不同位点分析方面的困难;最后针对影响S E R S磁免疫灵敏度提升的途径等进行展望.关键词:S E R S;磁免疫;联用技术;灵敏度;标记分子中图分类号:O 文献标志码:Ad o i:/j i s s n 收稿日期:,修改日期:基金项目:国家自然科学基金(N o ,)作者简介:张晨杰(),男,博士研究生,主要从事表面增强拉曼光谱研究,E m a i l:z h a n g c j s u d a e d u c n通讯作者:姚建林(),男,教授,主要从事表面增强谱学研究E m a i l:j l y a o s u d a e d u c nR e s e a r c hp r o g r e s s i nm a g n e t i c i mm u n o a s s a yb a s e do ns u r f a c ee n h a n c e dR a m a ns p e c t r o s c o p yZ HANGC h e n j i e,YAOJ i a n l i n(C o l l e g e o fC h e m i s t r y,C h e m i c a lE n g i n e e r i n ga n dM a t e r i a lS c i e n c e s,S o o c h o wU n i v e r s i t y,S u z h o u )A b s t r a c t:S u r f a c ee n h a n c e dR a m a ns p e c t r o s c o p y(S E R S)b a s e dm a g n e t i ci mm u n o a s s a yh a sa t t r a c t e dc o n s i d e r a b l ea t t e n t i o nd u et oi t sa b i l i t yt oa c h i e v er a p i ds e p a r a t i o n,e n r i c h m e n t,a n dn o n d e s t r u c t i v ed e t e c t i o no f t a r g e t sw i t hh i g hs e n s i t i v i t y,a c c u r a c ya n de f f i c i e n c y H e r e i n,t h ep r i n c i p l eo fS E R Sb a s e dm a g n e t i c i mm u n o a s s a ya n d i t sp r a c t i c a l a p p l i c a t i o n sw e r e r e v i e w e d;S E R Sb a s e dm a g n e t i c i mm u n o a s s a yc o m b i n e dw i t hm i c r o f l u i d i c,l a t e r a l f l o wa n a l y s i s,a n df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n t e c h n i q u e sw a s i n t r o d u c e d t os o l v e t h ed i f f i c u l t i e s i nr a p i dd e t e c t i o no f t r a c ea m o u n t s,m u l t i c o m p o n e n t a n a l y s i sa n d i d e n t i f i c a t i o no fd i f f e r e n t s i t e s f o ro v e r c o m i n gt h ed r a w b a c ki nl a c k i n gt h es p a t i o t e m p o r a l r e s o l u t i o n F i n a l l y,s e v e r a lm e t h o d st oi m p r o v e t h e s e n s i t i v i t ya n d f e a s i b i l i t yo f S E R Sb a s e dm a g n e t i c i mm u n o a s s a yw e r ep r o s p e c t e d K e yw o r d s:S E R S;M a g n e t i c i mm u n o a s s a y;C o m b i n e dd e t e c t i o nt e c h n o l o g y;S e n s i t i v i t y;l a b e l l e dm o l e c u l e s引言免疫分析法是利用抗原抗体选择性识别以及特异性结合反应的原理,对生物分子、药物、激素等各类物质进行分析检测的方法.按照是否加入标记示踪物,免疫分析法可分为非标记免疫与标记免疫分析法.前者仅通过抗原抗体结合时理化性质的变化来判断反应发生及进行程度,相较于非标记免疫分析法,标记免疫分析法的应用范围更为广泛,意义也更为重大.它是一种将敏感性的易测定示踪物质加到特异性抗原或者抗体上,通过测量示踪物质的信号从而间接获得目标待测物的含量.标记免疫分析法可细分为放射免疫分析(R I A)、荧 光免疫分析(F I A)、酶联 免 疫 分 析光散射学报第 卷(E L I S A)、化学发光免疫分析(C L I A)等一系列的检测手段.目前,标记免疫分析法在临床诊断、药物分析、食品安全及环境监测等研究领域中发挥着越来越重要的作用.然而,传统的免疫分析方法因所需设备价格高昂、操作流程复杂和耗时较长等缺点无法满足人们日益增长的检测需求,发展一种高灵敏度、快速、便捷的免疫分析方法十分迫切.表面增强拉曼光谱(s u r f a c ee n h a n c e dR a m a ns p e c t r o s c o p y,S E R S)是一种具有单分子检测灵敏度的表面分析技术,其具有许多突出的优点,如S E R S谱峰较窄可避免多种物质检测时特征峰的重叠效应,同时它不受水干扰可应用于生物细胞体系中,且不受光致褪色的影响,可长时间测试.但将S E R S应用到生物细胞体系也有许多困难,如生物细胞内成分复杂,导致S E R S谱图复杂,为谱图解析带来了技术上的困难.近年来,研究者将S E R S技术与标记免疫分析技术相结合,发展了一种基于S E R S的标记免疫分析法,S E R S标记免疫技术是在生物免疫应答的基础上发展起来的,“三明治”结构最早于上世纪八十年代由R o h r小组提出,即基底上的固相抗体与标记抗体通过与抗原的结合形成“固相抗体待测抗原标记抗体”夹心复合物,通过对标记分子S E R S信号的识别进行免疫分析.而将其运用到生物体系中,可通过其高灵敏度和高选择性的特点对生物分子进行识别和检测,从而可获得与表面或界面分子的构象、活性及取向等相关信息,以实现表界面物种的超灵敏检测.S E R S磁免疫的发展历程基于固相基底的S E R S标记免疫分析技术是一种检测目标分子的有效方法,但其也存在比较明显的缺陷,例如:固相基底上的免疫分析法所经历的组装时间长、清洗过程冗长繁琐;由于固相基底和免疫溶胶间进行的是异相反应,抗体抗原免疫复合物的组装效率低,极大程度上限制其检测灵敏度.为简化实验步骤、提高检测灵敏度,研究者提出一方面在免疫A u溶胶上组装具有双官能团的分子(如对巯基苯甲酸,MB A),MB A可通过巯基(S H)与A u纳米粒子相连,MB A的羧基端(C O OH)可与抗体抗原蛋白质中的氨基(NH)相连.MB A不仅是标记分子也是连接剂,无需在金纳米粒子表面为抗体或抗原留出空位,可提高标记分子的吸附量,提高S E R S检测灵敏度.P o r t e r等人报道了采用双官能团标记分子提高检测的灵敏度,其待测抗原的检出限达到了p gm L;另一方面研究者提出以免疫磁珠代替固相基底构建“三明治”结构,发展了S E R S磁免疫技术.其相较于固相基底免疫有几大优势:()纳米粒子比固相平面基底有着更大的比表面积,可捕获更多的目标待测物以提高灵敏度;()磁珠、抗原和标记免疫溶胶均在液相中可充分接触,省去了繁杂的组装过程,节省了孵化时间;()免疫形成的复合物可轻松地通过磁场将其与反应混合物分离,省去繁琐清洗步骤;()通过外磁场,可迅速将目标物富集至很小的体积,有利于提高检测灵敏度;()通过延长磁场作用时间或加大磁场强度,可使富集的复合物在磁场作用下进一步减小间距使粒子间的耦合作用进一步增强,进一步提高了标记分子的S E R S信号强度,实现对目标抗原的超灵敏度检测.S E R S磁免疫自诞生以来发展迅速,本文综述了非竞争性S E R S磁免疫和竞争性S E R S磁免疫在国内外的研究进展及应用,讨论了S E R S磁免疫与其他技术联用技术,最后针对S E R S磁免疫目前存在的问题展望了S E R S磁免疫未来的研究方向.S E R S磁免疫原理及应用 非竞争性S E R S磁免疫:“三明治”结构大分子抗原因其表面可供吸附的活性识别位点较多,根据抗原抗体的特异性结合作用常搭建“磁珠抗体目标抗原标记分子、抗体修饰的免疫溶胶”的“三明治”结构复合物实现对目标抗原的检测.图为非竞争性S E R S磁分离免疫检测法的基本原理,将抗原加入到免疫磁珠(免疫修饰的磁性内核A u外壳层的纳米粒子)和标记免疫A u纳米粒子的混合物中,由于抗体和抗原之间的特异性结合可形成如下三种结构:标记免疫A u纳米粒子之间相互连接;免疫磁珠之间的相互连接;标记免疫A u纳米粒子和免疫磁珠之间相互连接.当施加额外的磁场时,只有连有免疫磁珠的结构会被定向富集,即第和第种复合结构.而第种复合结构未被定向富集且仍留在溶液中,部分随其他复合结构富集的复合物可简单地通过清洗除去以消除其S E R S信号的干扰.在S E R S检测过程中只有第种结构,即免疫A u纳第期张晨杰:表面增强拉曼光谱磁免疫分析研究进展米粒子和免疫磁珠之间相互连接中包含S E R S探针,在激光照射下可以产生S E R S信号.其S E R S信号强度与目标分析物的含量在一定浓度范围内呈正相关性,以此实现对目标分析物的高灵敏检测.图“三明治”S E R S磁免疫分析示意图F i g S c h e m a t i cd i a g r a mo f m a g n e t i c i mm u n o a s s a yb a s e do nS E R Sb a s e do ns a n d w i c hs t r u c t u r e本课题组C h e n等人以溶液中的目标抗原分子为桥梁,将抗体修饰的免疫 F eOA u与抗体修饰的免疫A u纳米粒子通过“三明治”结构进行组装,并引入外磁场磁富集免疫复合物,对其进行S E R S检测,复合物的S E R S信号强度与目标抗原浓度在一定浓度范围内呈正相关性,其检测限可达到 f g