百合地黄汤抗抑郁作用机制初探.pdf

博硕园地 福建中医药 2023 年 7 月 第 54 卷 第 7 期Fujian Journal of TCM July 2023，54（7）百合地黄汤抗抑郁作用机制初探周小如，贾铷，陈燕，林霈佳，王玉露*（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）摘要：目的 探讨百合地黄汤对慢性不可预知应激（CUS）抑郁小鼠的抗抑郁作用及机制。方法 将60只ICR小鼠根据糖水偏嗜度随机分为空白组10只和造模组50只，造模组再随机分为模型组、咯利普兰组、低剂量组、中剂量组、高剂量组各10只。造模组采用CUS法制备小鼠抑郁模型，造模周期35 d；空白组正常饲养。低、中、高剂量组每日按体质量 20 mL/kg 灌胃 0.3、0.6、1.2 g/mL 百合地黄汤药液，空白组及模型组每日按体质量20 mL/kg灌胃生理盐水，咯利普兰组每日按体质量10 mL/kg腹腔注射0.1 mg/mL咯利普兰药液，连续干预35 d。采用糖水偏好试验、旷场试验、强迫游泳试验、新奇抑制摄食试验、大理石埋藏试验、高架十字迷宫试验和Y迷宫空间试验检测6组小鼠行为学变化；ELISA法检测6组小鼠血清促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质酮（CORT）含量以及海马组织中cAMP含量。另将50只ICR小鼠根据体质量随机分为空白组、咯利普兰组、低剂量组、中剂量组、高剂量组各10只，5组给药方法和剂量同上，给药1 h后按体质量10 mL/kg腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，观察5组翻正反射恢复时间 结果 与空白组比较，模型组糖水偏好试验的糖水偏嗜度明显降低，旷场试验的水平和垂直次数明显减少，强迫游泳试验的游泳不动时间增加，新奇抑制摄食试验的摄食潜伏期延长，大理石埋藏试验的埋藏弹珠数目增加，高架十字迷宫试验的开臂时间百分比、开臂次数百分比及入臂总次数下降，Y迷宫空间试验的交替反应率下降（P均0.05），血清ACTH和CORT含量明显升高，海马组织中cAMP含量明显降低（P均0.05）；与模型组比较，咯利普兰组和各剂量组上述行为学指标均有改善，血清ACTH和CORT含量明显下降，海马组织中cAMP含量明显升高（P均0.05）；与空白组比较，咯利普兰组翻正反射恢复时间明显减少（P0.05），各剂量组翻正反射恢复时间均无明显变化（P均0.05）。结论 百合地黄汤有显著的抗抑郁作用，且没有咯利普兰导致的呕吐不良反应，其作用机制与抑制ACTH和CORT含量和提升小鼠海马cAMP含量有关。关键词：抑郁症；慢性不可预知应激；百合地黄汤；行为学试验抑郁症是一种严重影响人的思想、行为、感觉的精神疾病，临床常见患者快感缺乏，意志消沉，亦会出现焦虑、记忆力衰退等症状。据统计我国目前约有 5 000万人群罹患该病，是负担较为严重的国家之一。下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalmic-pituitary-adrenal axis，HPA）抑郁发病假说是近年来的研究热点之一1，长期应激会促使 HPA 过度激活，血清促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质酮（CORT）大量分泌，高浓度 ACTH 和 CORT 进而造成对海马等脑区的结构功能损伤，该病理现象是导致抑郁的机制之一。而环磷酸腺苷（cAMP）作为细胞内重要的第二信使，可适当调节HPA轴2。百合地黄汤是经典抗抑郁中药方剂的名方之一，由百合、生地黄组成，具有养阴清热、补益心肺功效，广泛应用于神经病学与中医内科学等研究领域，目前该方的研究主要集中在增加单胺类神经递质以及抗炎症因子方面，对是否作用于 HPA 轴和cAMP 方面暂未见报道。因此，本研究拟采用经典的慢性不可预知应激（chronic unpredictable stress，CUS）抑郁模型小鼠为研究对象，探究百合地黄汤的抗抑郁作用及其机制是否与 HPA 轴和 cAMP 相关，为百合地黄汤的后续研究应用提供基础实验支持。1实验材料1.1实验动物清洁级 ICR 小鼠 110 只，雄性，体质量1822 g，购于上海斯莱克实验室动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005，饲养于福建中医药大学实验动物中心 SPF 级动物实验室，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。动物分笼，在安静、避强光且通风的实验室内，温度（202），自然昼夜，自由食水，适应性饲养7 d。1.2药物与试剂百合（北京本草方源药业科技有限公司，产品批号：2020801）；生地黄（焦作市杜盛兴中药饮片有限公司，产品批号：20200302）；咯利普兰（上海源叶生物科技有限公司，产品批号：B12O8D45448）；二甲基亚砜（北京索莱宝科技有限公司，产品批号：1213C0215）；戊巴比妥钠（佛山市化工实验厂，产品批号：20160121）；cAMP 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，产品批号：ml038385）；ACTH试剂盒（上海西塘生物科技有限公司，产品批号：1605221）；皮质酮（CORT）试剂盒（美国Enzo Life Sciences公司，产品批号：12021511E）。收稿日期：2023-02-10基金项目：福建省自然科学基金项目（2021J01923）；福建中医药大学校管课题（X2019004-重点）；福建中医药大学校管课题（X2019030）通信作者：王玉露，Email：DOI：10.13260/ki.jfjtcm.2023.0701448周小如 等：百合地黄汤抗抑郁作用机制初探第 7 期1.3实验仪器小鼠旷场箱：用木制箱（50 cm50 cm50 cm）自制，底面用黑线划分成面积相等的 25 个正方形方格，由每行和每列各 5 个方格构成；高架十字迷宫：用黑色塑胶自制，由相互垂直呈十字状两个开臂（50 cm10 cm）、两个闭臂（50 cm10 cm40 cm）及一个中央平台（10 cm10 cm）构成，并固定于高 50 cm 十字支架上；Y迷宫：用黑色塑胶自制，由三条形成 120夹角的支臂（40 cm3 cm15 cm）及一个中心区域（10 cm10 cm）构成；低温离心机（德国Eppendorf公司，型号：5804R）。2实验方法2.1药物的制备以 4 3比例称取百合、生地黄，加入药材总质量 10 倍的蒸馏水浸泡 0.5 h，煎煮1 h，过滤后收集滤液，再加药材总质量 8倍的蒸馏水，重复以上步骤，合并2次药液，将药液浓缩至含生药量1.2 g/mL百合地黄汤药液，置4 冰箱保存备用；用 1%二甲基亚砜配制 0.1 mg/mL 咯利普兰溶液；用生理盐水配制0.8%戊巴比妥钠溶液。2.2筛选动物将60只ICR小鼠进行适应性喂养7 d，第 8、9 天进行糖水适应性训练，依据文献 3进行操作：第 8 天放入 2 瓶装有 1蔗糖水溶液的饮水瓶；第 9 天将其中 1 瓶 1蔗糖水溶液换成蒸馏水溶液；第10天所有小鼠禁食禁水24 h；第11天让每只小鼠自由饮用1瓶1%蔗糖水和1瓶蒸馏水，测量并记录 2 h的小鼠饮用量。根据 蔗糖水饮用量/（蔗糖水饮用量蒸馏水饮用量）100%计算糖水偏嗜度，通过糖水偏嗜度的高低进行分组，分组时应尽量使每组的糖水偏嗜度的平均值相互接近。2.3动物分组与给药依据文献 4，根据糖水偏嗜度随机分为空白组，模型组，咯利普兰组，低、中、高剂量组，每组 10 只。低、中、高剂量组每日按体质量20 mL/kg灌胃0.3、0.6、1.2 g/mL百合地黄汤药液，空白组及模型组每日按体质量 20 mL/kg 灌胃生理盐水，咯利普兰组每日按体质量 10 mL/kg 腹腔注射0.1 mg/mL咯利普兰药液，连续干预35 d5。除空白组外，其余各组给药同时均进行CUS造模。2.4CUS 造模除空白组，其余各组均按照下列应激程序进行造模：24 h小鼠禁食或禁水；4 冰水游泳 5 min；距离尾尖 1 cm 处夹尾 1 min；潮湿垫料过夜；闻大鼠垫料 34 h；倾斜鼠笼 30过夜；通宵照明。每天连续随机施加不同应激1次或2次，每周更改应激顺序，使应激过程变得不可预测6。2.5指标测定2.5.1糖水偏好试验同“2.2”项下的测定方法测定糖水偏嗜度。2.5.2旷场试验将每只小鼠从同一角落放入旷场箱中，记录5 min内穿越底面的方格数（即水平次数）和双后肢直立次数（即垂直次数）7。2.5.3强迫游泳试验将小鼠放入透明玻璃容器其规格为直径13 cm，高19.5 cm，水深为10 cm，水温为（252）中6 min，记录后4 min内小鼠停止挣扎并保持漂浮在水中不动，或为了使头部保持在水面之上仅进行小幅度动作的时间，即游泳不动时间8。2.5.4新奇抑制摄食试验在旷场箱底部铺 12 cm 厚的垫料，中间放 12 个大小一样的饲料。禁食 24 h后，将小鼠置于箱内（均放在同一位置），记录小鼠在 5 min内开始啃食饲料的时间，即摄食潜伏期9。2.5.5高架十字迷宫试验将小鼠放在高架十字迷宫的中心枢纽处，面向开闭，记录5 min内进入闭臂次数（CE）、开臂次数（OE）以及闭臂停留时间（CT）、开臂停留时间（OT），计算开臂时间百分比、开臂次数百分比和入臂总次数10。公式如下：开臂时间百分比OT/（OTCT）100%开臂次数百分比OE/（OECE）100%入臂总次数OECE2.5.6大理石埋藏试验在铺有 5 cm 垫料、上面放置 20颗玻璃弹珠（直径为 1.5 cm）大鼠笼中进行大理石埋藏试验，记录小鼠10 min内埋藏的玻璃弹珠数量。玻璃弹珠被至少2/3覆盖在垫料中，即视为被埋藏11。2.5.7Y 迷宫空间试验将小鼠头朝同一方向放入 Y 迷宫的中心区域，记录 8 min 内小鼠在 3 个支臂的正确交替反应的次数（即当小鼠连续进入3个不同支臂时，视为其完成了一次正确的交替反应）以及总次数（N）12，计算交替反应率，公式如下：交替反应率 正确交替反应次数/（N-2）1002.5.8ELISA 法检测血清 CORT 和 ACTH 含量行为学试验结束后每组取4只小鼠按体质量10 mL/kg腹腔注射 1%戊巴比妥钠麻醉后取血，室温静置30 min，4 低温离心机以3 000 r/min离心30 min，分离血清，按 ELISA 试剂盒说明书检测血清 CORT和ACTH含量。2.5.9ELISA法检测小鼠海马cAMP含量行为学试验结束后每组取3只小鼠颈椎脱臼处死，在冰上根据小鼠大脑图谱分离双侧海马，按ELISA试剂盒说明书检测小鼠海马cAMP含量。2.6翻正反射恢复时间测定将ICR小鼠50只按体质量随机分为空白组，咯利普兰组，低、中、高剂量组共 5 组，每组 10 只。各组给药方法和剂量同“2.3”项下，给药1 h后按体质量10 mL/kg腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，观察 5 组翻正反射恢复时间13，即小鼠麻醉后自主醒来取俯卧位，并在将其翻为仰卧位后能在 30 s内自动又翻回俯卧位所用的时间。49福建中医药第 54 卷2.7统计学方法采用 GrphPad Prism 5.0 软件进行数据处理。计量资料符合正态分布的以（x s）表示，两两比较方差齐采用 LSD-t 检验，多组间比较采用方差分析。P0.05表示差异具有统计学意义。3结果3.16 组小鼠抑郁样行为学指标比较结果显示百合地黄汤各剂量组能明显改善抑郁模型小鼠的抑郁样行为，作用与咯利普兰组相当。见表1。3.26 组小鼠焦虑样行为学指标比较结果显示百合地黄汤各剂量组可显著改善抑郁模型小鼠焦虑样行为，作用与咯利普兰组相当。见表2。3.36 组小鼠空间工作记忆行为学指标比较结果显示百合地黄汤中、高剂量组能改善抑郁模型小鼠工作记忆下降的作用，作用与咯利普兰组相当。见表3。3.46组小鼠ACTH和CORT含量比较结果显示百合地黄汤各剂量组能改善抑郁模型小鼠HPA轴激活的状态，作用与咯利普兰组相当。见表4。3.56组小鼠海马cAMP含量比较结果显示百合地黄汤各剂量组能提高抑郁模型小鼠海马 cAMP含量，作用与咯利普兰组相当。见表5。表16组小鼠抑郁样行为学指标比较（x s）组别空白组模型组咯利普兰组低剂量组中剂量组高剂量组n101010101010糖水偏嗜度/%7