杞麓鲤保种群体的遗传结构分析_刘娟.pdf

淡水渔业，2023，53(2):21 28Freshwater Fisheries2023 年 3 月Mar.2023收稿日期:2022-07-20;修订日期:2022-10-25资助项目:云南省重大科技专项(202202AE090018);云南省农业联合专项(202101BD070001-039);国家自然科学基金(32060827)第一作者简介:刘娟(1999)，女，学士，专业方向为云南土著鱼类养殖与繁育研究。E-mail:2247973446 qq com通讯作者:武祥伟。E-mail:wxw9559126 com杞麓鲤保种群体的遗传结构分析刘娟1，袁林聪2，李伟斌2，白寿有2，李进荣2，蔡实旺2，尹馨玉1，孔令富1，武祥伟1(1 云南农业大学动物科学技术学院，昆明 361021;2 元江县鱼种技术推广站，云南元江 653300)摘要:杞麓鲤(Cyprinus carpio chilia)是云南特有水产种质资源，为研究杞麓鲤保种群体的遗传结构，本研究开发了 15 个多态性高的杞麓鲤微卫星(SS)分子标记，并对保种群体进行了 SS 分析。结果显示:杞麓鲤保种群体40 个个体的平均等位基因数为 7 8个，有效等位基因数为 3 2 8 9，期望杂合度为 0 696 4 0 900 0，多态信息含量为0 647 6 0 877 0，保种群体遗传多样性水平较高。基于突变模型与等位基因分布均检测到了保种群体的瓶颈效应，近交系数 Fis为 0 249 7，保种群体存在近交现象，并且 10 个 SS 位点偏离 Hardy-Weinberg 平衡。结果表明杞麓鲤保种群体的遗传多样性较高，但经历了瓶颈效应，不利于继续保种。关键词:杞麓鲤(Cyprinus carpio chilia);微卫星;遗传结构;种质资源;保种群体;瓶颈效应中图分类号:S917 4文献标识码:A文章编号:1000-6907-(2023)02-0021-08我国具有丰富的鲤种质资源和悠久的养殖历史，鲤亚科鱼类区系远较其他国家丰富，地方种多达 23 种，其中分布于云南的鲤亚科鱼类多达 4 属18 种，云南高原特有种多达 12 种1 4。杞麓鲤(Cyprinus carpio chilia)即是其中一种，主要分布于云南境内高原湖泊中，是我国普通鲤(C carpioLinnaeus)四大亚种之一2，在上世纪六七十年代它是星云湖、杞麓湖等湖泊中的主要经济鱼类与捕捞对象3，5。云南高原特有鱼类生境相对狭窄，对原生境依赖性高，生境变化对它们的生存影响较大。近年来云南高原湖泊外来鱼类入侵、水质污染以及资源和环境过度利用等致使土居种或地方特有种种群数量急剧减少，种质资源退化、外来鱼类基因渐渗等问题日益突出6 8。因此，在本世纪初云南境内渔业相关单位以抚仙湖及其水系中的野生种为基础群体，开展了杞麓鲤种质资源保存工作，在杞麓鲤人工繁殖方面取得了突破9 10，但保种群体的遗传结构尚不清楚，不利于种群后续保种与提纯复壮。微卫星分子标记是广泛分布于基因组中的简单串联重复序列(simple sequence repeats，SS)，基于DNA 变异而呈现丰富的多态性，并且它还具有数量多、通用性好，易于操作等特点11 13，被广泛运用于水产动物的群体遗传结构分析、种质资源遗传监 测、遗 传 图 谱 构 建 和 分 子 辅 助 育 种 等 方面14 15。本研究从杞麓鲤基因组序列中筛选了多态性高的微卫星分子标记，使用这些分子标记对杞麓鲤保种群体进行遗传变异研究，评价保种群体的遗传结构和遗传多样性水平，以期为杞麓鲤种质资源保护与提纯复壮提供理论支撑。1材料与方法11实验材料杞麓鲤为玉溪市江川区水产技术推广站养殖基地保种至第四代群体，为 2 龄个体且均已性成熟，体重(1 198 70 371 64)g，体长(35 90 5 08)cm。随机选取 40 尾个体，剪取鳍条组织，使用无水乙醇固定并保存于 20 备用。12基因组 DNA 抽提采用传统的酚-氯仿-异戊醇法16 进行基因组DNA 提取，纯化后稀释至 50 ng/L，4 保存备用。13微卫星位点的开发使用 GMATA 2 0程序17 从杞麓鲤基因组序列中查找 SS 位点并设计 PC 引物，经 PC 扩增验证后从中随机选取 15 个多态性高的 SS 位点用于DOI:10.13721/ki.dsyy.2023.02.009淡水渔业2023 年群体遗传结构分析(表1)。表 1杞麓鲤 15 对微卫星引物序列与特征Tab 1Sequences and characteristics of fifteen pairs of microsatellite primers for C carpio chilia微卫星位点引物序列(53)退火温度/片段大小/bp核心重复序列YJL048F:CCTCCAGCCATAGGTCAAAG58254(TG)61:CCTTTGGAGGAAATTCAGACCYJL057F:CGGCAGACAGACTTGTGATG58299(TC)63:ACGACAGCATGACACAAAGCYJL061F:ACTGATGGATGGATGGATGG58374(GATA)30:GTCATGGGTCTGTTCCGACTYJL066F:GCGCCTTCATTCATCACATA60367(TC)85:CCACCACTGGAGAAACAGGAYJL072F:CAATGGAATGCCAGTAAGACA58319(GATA)42:GTGCACAGATTTGCCAAGAAYJL073F:GAACTGCAAAGCAAAACAGC58393(TAGA)40:GAACAACCAAGTGTTGCATGAYJL075F:AAGCCCAAAGATCTGCCTCT58291(AGAT)35:TGCAATGTGCTGAGATTATGCYJL076F:ATTTATTGCCATTGCCCTTG58396(CA)81:TGGGGAACCAGAACAACTTTYJL077F:GGTGCAGAGCTACACGGACT58369AT70A23:GGGTCCAGATCGTCCAGATAYJL080F:AAACATGGGTAGAGTGCAGGA58355(GAAA)35:GTCCTGACTGGAGCTGAAGGYJL081F:TAGTGCTTTCTTCCGGCTGT58317(GATA)41:TTCTTTCTTCCCGCAGATGTYJL082F:GCCATTCCTCAAGCAACAAT58385(ATCT)36(GTCT)12:CAGACCGACAAACACACAGAAYJL086F:CATTTGGTTGCAGGGAAAAT58394(CA)67:TGGAGGTCCATAGCATAGGAGYJL092F:TGCCAAGCATTAGATTGAAGAG58397(TA)69:GTTTTGCCCAACAACAAACCYJL093F:CTCTCACATGGTCGTGCATC60398(ATCT)39:TGTGCTTAGTGGCTTTGCTG14PC 扩增与电泳PC 反应体系为 10 L，其中 PC mix(Taka-ra，大连宝生物工程有限公司)8 L，上、下游引物各 0 4 L，模板 DNA 1 2 L。PC 反应程序为95 预变性 5 min，95 变性 30 s，58 或 60 退火 30 s，72 延伸 30 s，25 个循环，最后 72 延22第 2 期刘娟等:杞麓鲤保种群体的遗传结构分析伸 10 min，4 保存。PC 产物进行 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经固定、银染、显色后，统计 SS 等位基因条带数。15数据分析使用 popgene32 v1 32 软件18分析群体的观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Shannons 信息指数(I)，使用 FSTAT v2 9软件19 计算 SS 位点的多态信息含量(PIC)、固定指数(Fis)、Neis遗传距离(D)，并进行哈代-温伯格平衡(HWE)2检验。使用 Bottleneck v1 2 02 软件20 采用两种方法评估群体瓶颈效应，一是杂合度过剩检验，基于无限 等 位 基 因 突 变 模 型(Infinite allele model，IAM)、双相突变模型(Two phased model of muta-tion，TPM)和 逐 步 突 变 模 型(Stepwise mutationmodel，SMM)计算群体平均期望杂合度(Heq)，Heq与根据等位基因频率计算的 He比较，使用标记检验(sign test)和标记秩检验(wilcoxon sign rank test)对杂合度过剩与否进行显著性检测;二是分析等位基因频率分布，在平衡群体中等位基因频率分布柱状图呈“L”形，而经历过瓶颈效应的群体，等位基因频率发生迁移，偏离平衡状态下的“L”形分布21。根据 Nei s 遗传距离使用MEGA 10 1软件包22 构建杞麓鲤群体的系统发育邻接树(neighbor-joining，NJ)，设置 Bootstrap 1 000次重复抽样检验。2结果与分析21遗传多样性分析在杞麓鲤群体中 15 个 SS 位点均能特异性扩增(图1)，共监测到 117 个等位基因，平均等位基因数为 7 8个/位点，有效等位基因数为 3 2 8 9个，平均值为 5 8个/位点;期望杂合度为 0 696 40 900 0，平均值为 0 824 4;多态信息含量 PIC为 0 647 6 0 877 0;其中 2 个 SS 位点属于中度多态(0 5 PIC 0 7)，13 个 SS 位点属于高度多态(PIC0 7)，PIC 平均值为 0 790 3，表明杞麓鲤保种群体具有较高水平的遗传多样性(表2)。图 1杞麓鲤 1 24 个体微卫星分子标记聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱Fig 1Fingerprint of polyacrylamide gel electrophoresisof microsatellite markers for 24 individuals of C carpio chiliaa:YJL048，b:YJL073，c:YJL075，M:marker22Hardy-Weinberg 平衡检验Hardy-Weinberg 平衡检验结果表明 10 个 SS位点偏离平衡状态，其中 8 个位点极显著偏离平衡。SS 位点 YJL057 与 YJL073 的近交系数 Fis小于 0，表现杂合子过剩，其余 13 个位点的 Fis值位于0 054 3 0 634 7 之间，表现杂合子缺失，保种群体的近交系数 Fis均值为 0 237 1，近交系数较高，群体内个体间存在一定程度的近交(表2)。表 2杞麓鲤保种群体的遗传多样性参数与 F-统计量Tab 2Genetic diversity and F-statistics of 15 microsatellite loci in C carpio chilia位点NaNeHoHePICIPHWEFisYJL04896 60 600 00 858 90 831 52 034 40 000 0 0 292 6YJL05785 560 825 00 829 40 796 51 854 10 574 00 007 0YJL06164 460 300 00 784 50 741 41 620 60 000 0 0 612 7YJL066107 160 794 90 870 80 846 12 141 80 187 30 075 3YJL07286 40 368 40 854 40 824 01 946 70 000 0 0 563 0YJL07385 20 871 80 819 20 786 01 838 60 897 30 078 0YJL07584 80 700 00 802 80 767 21 784 50 010 0*0 117 1YJL07653 50 675