人源硫酸盐转运蛋白DTDST的结构生物学研究_池希敏.pdf

第 卷 第 期 年 月电 子 显 微 学 报 ，文章编号：（）人源硫酸盐转运蛋白 的结构生物学研究池希敏，李晓荣，黄邦栋，周 强，（西湖大学生命科学学院，西湖实验室（生命科学和生物医学浙江省实验室），浙江省结构生物学研究重点实验室，浙江 杭州；浙江西湖高等研究院，生物学研究所，浙江 杭州）摘 要软骨畸形发育不良（）是一种严重的常染色体隐性遗传疾病，由畸形发育不良硫酸盐转运蛋白（，）的突变引起，目前没有有效的治疗手段。也称为，属于人源溶质转运蛋白 家族。由于缺乏必要的结构信息，针对 的药物研发进展缓慢。本研究解析了人源硫酸盐转运蛋白 的冷冻电镜三维结构，揭示了其二聚化作用界面和底物结合口袋的结构特征，并比较了 和已报道的其他同源蛋白的构象。该研究结果加深了对 家族蛋白底物识别和转运机制的了解，为治疗软骨畸形发育不良的药物开发提供了结构基础。关键词 硫酸盐转运蛋白；软骨畸形发育不良；冷冻电镜结构中图分类号：；文献标识码：收稿日期：；修订日期：基金项目：国家自然科学基金资助项目（）；中国博士后科学基金资助项目（）作者简介：池希敏（），女（汉族），福建人，博士：通讯作者：周强（），男（汉族），黑龙江人，研究员：人源溶质转运蛋白 家族涵盖了 个基因，除了其中 为假基因外，其他均能编码蛋白，这些蛋白能够转运多种阴离子，包括氯离子、碘离子、硫酸根离子、碳酸氢根离子、草酸根离子、甲酸根离子、氢氧根离子等。家族蛋白的功能缺失会引起多种疾病，包括氯性腹泻、彭德莱综合征、耳聋、甲状腺肿大等。人源溶质转运蛋白 是一种硫酸盐碳酸氢盐草酸的交换转运蛋白，又称为畸形发育不良硫酸盐转运蛋白（）。年，美国学者对软骨畸形发育不良基因的位置进行连锁不平衡定位 分 析，在 遗 传 孤 立 的 芬 兰 人 群 中 发 现 了。在各种组织器官中普遍存在，并于上皮细胞和结缔组织中高水平表达。作为硫酸根的转运蛋白，为蛋白多糖硫酸化修饰提供原料，因此在软骨的发育过程中起到重要的作用。在软骨发 育 不 全 患 者 中 发 现 了 的 纯合子突变，这种突变减少了成纤维细胞和软骨细胞对硫酸盐的摄入，导致骨骺处软骨内成骨紊乱，最终破坏关节软骨的正常形成，导致软骨畸形，严重的骨骼发育不良还会导致死胎或新生儿分娩后的快速死亡。的突变在全世界各类人群中均有发现，患者在芬兰较为集中。目前对于这类疾病还没有特效药物。另外，尽管其他 家族蛋白的异常也和很多疾病相关，但目前都还没有针对性的药物，因此研究 家族蛋白的结构以及转运机制对于药物的开发具有重要参考意义。年学术界解析了首个 家族蛋白的细菌同源结构。随着冷冻电镜技术的革新，近年对于 家族蛋白的结构研究取得了进一步进展。年蓝藻的 家族同源物 的结构揭示了细胞内结构域的作用以及其识别底物碳酸氢根离子的结构口袋。年 研究组发表了小鼠 的结构，揭示了哺乳动物中该家族的二聚体结构特征。在 年，本课题组解析了人源 的高分辨率结构，首次发现了其 端序列具有转运活性的自抑制功能，并揭示了多个新的离子结合位点。在 年，在 和 杂志上分别报道了（）多个构象的冷冻电镜结构，揭示了 的结构重排是如何与蛋白质细胞膜界面的构象转变相互耦合的，为耳蜗外毛细胞的声音放大机 制 提 供 了 一 种 解 释。以 上 研 究 对 家族底物识别和构象变化提供了重要的参考信息。然而，对于 家族蛋白，尤其是其中 电子显微学报 第 卷的，是如何识别硫酸根离子并进行离子转运的，目前还没有结构信息。本工作从以上问题出发，使用冷冻电镜单颗粒三维重构技术，首次解析了人源 的结构，分辨率达到 （图）。由此搭建了蛋白结构模型，揭示了其结构域排布方式，以及识别底物硫酸根离子的结构基础。本工作的发现为治疗 异常造成软骨发育不全的药物开发奠定了基础。图 人源 总体结构。左为 的电镜密度图，右为 的原子模型。分别用红色和蓝色代表不同的亚基，细胞外侧为上，细胞质侧为下；按结构域着色的原子模型，跨膜区又分为核心（）结构域和门控（）结构域。核心结构域着粉色，门控结构域着淡蓝色，结构域着绿色，图 和图 也按此着色示意；细胞质一侧观察（将 图沿着水平轴旋转约，使 结构域转到面向读者侧），展示跨膜螺旋区核心和门控结构域 分布；放大显示 结构域（将 图沿着二次对称轴旋），其中 端（）序列着金色，它靠近 结构域 和 一侧。：，；，；（）；（）材料与方法 人源 蛋白的表达纯化与冷冻样品制备 人源 蛋白序列质粒购自淼灵生物，亚克隆到 表达载体上后通过 转染试剂在 细胞系中瞬时转染（端 和 双标签）。转染 后收集细胞，重悬在裂解缓冲液（，）加入（）和 （）以及蛋白酶抑制剂进行全细胞裂解和膜蛋白溶解。高速离心后上清液流过 标签 抗体耦合树脂进行亲和纯化，柱材用 倍体积清洗液（含 ，硫酸钠以及蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液）清洗后，使用洗脱液（含 多肽的清洗液）进行洗脱。接着洗脱液流过 琼脂糖凝胶树脂，柱材用 倍体积清洗液（与上述清洗液相同）清洗后，使用含 脱硫生物素的 清 洗 液 进 行 洗 脱。接 着 将 蛋 白 用 浓 缩 管（，）浓缩至 左右，使用清洗液平衡过的 进行进一步的分子筛纯化，经 分析后选取蛋白进行冷冻样品制备。第 期池希敏等：人源硫酸盐转运蛋白 的结构生物学研究 冷冻样品制备使用赛默飞公司的 ，样品室温度为 ，湿度为。在表面等离子清洗处理过的 金网上加入 微升样品，滤纸吸去表面多余液体，快速冻到液态乙烷中，再转移到液氮中保存。数据收集和结构解析 冷冻电镜数据在 加速电压并配备了 探测器和 量子能量过滤器的赛默飞公司高端透射电镜 上使用 软件自动收集。能量过滤器上的狭缝宽度设置为 ，名义放大倍数为，使用超分辨率模式进行数据收集，欠焦范围约 ，像素大小为 。每个照片曝光总时间为 ，每帧曝光时间为 ，共有 帧。每 组 的 总 剂 量 率 约 为 。使 用对这些照片进行位移校正，用 算法估算欠焦值。接着使用 进行数据处理。首先从人工选择的电镜照片中利用 自动挑选出蛋白颗粒。经过多轮二维分类后选取较好的颗粒，从基于 生成的初始模型开始进行迭代，进行全角度搜索三维分类。接着进行多参考三维分类，将颗粒分为 类。选出三维分类中良好的颗粒进行局部欠焦矫正、三维重构优化和后处理。最后用金标准的傅里叶壳相关系数 标准估计分辨率。数据采集和处理过程详见图 和表。图 的电镜数据分析。数据处理过程的简要示意图，详见 小节；的局部分辨率示意图；优化后电镜密度图的金标准 曲线；的 角度分布图；原子模型对应电镜密度图计算的 曲线（黑色曲线），根据半份密度图优化的模型对同半份密度图计算的 曲线以红色表示，根据半份密 度图优化的模型对另一半份密度图计算的 曲线以绿色表示，红色和绿色曲线之间的微小差异表明搭建的原子模型没有过度拟合。；（）；（）；（）电子显微学报 第 卷表 数据收集，重构和模型参数统计表 ，数据收集电镜（赛默飞 ）加速电压 检测器 能量过滤器 ，像素 电子剂量（）欠焦范围 样品名称收集照片数目 选择照片数目 重构软件对称性所使用的颗粒数 分辨率 密度图锐化温度因子（）优化相关参数软件密度图维度（）（）原子模型参数搭建侧链的残基数目 糖的数量配体硫酸根离子偏差键长 键角（）图统计 良好 允许 不允许 结构模型搭建 基于冷冻电镜密度图进行模型搭建。利用和 以 结构模型为同源模型进行 模型的搭建，使用 软件包中的 生成 的初始模型。在模型建立过程中，根据化学性质对每个氨基酸进行人工检查。部分序列由于密度质量不够而没有建模。使用，在二级结构和化学键约束下对结构进行实空间优化。为防止模型过度拟合，模型是根据在金标准三维优化中两个独立的半电子密度图之一进行优化的。然后，将优化后的模型与另一个半电子密度图进行对比，结果详见图。结果 人源 转运蛋白整体结构 从 细胞中异源过表达并分离纯化人源 蛋白，在 电镜上进行了数据的收集，选出了 张好的电镜照片，使用 进行数据分析。又经过多轮 和 分类，选出 个蛋白颗粒进行三维重构，得到了人源 的冷冻电镜结构，整体分辨率达到 ，核心区域分辨率达到 ，约 的蛋白序列可以此搭建结构模型（图，表）。分析结构可以发现 和 此 前 报 道 的 以 及结构类似，均为蛋白二聚体，可以分为跨膜区和细胞质可溶区两个结构域。二聚体采取交互排布的形式，一个亚基的可溶区附在另一个亚基的跨膜区下方（图，）。单个亚基的跨膜区由 个跨膜螺旋（，）构成。和 互为反向重复的结构单元，属于 折叠。其中 和 构成核心结构域（），和 构成门控结构域（），两个结构域之间通过 和，和，以及 和 之间的环区相连，这些连接较为松散，为转运发生时两者相对的构象变化提供了空间（图）。细胞质可溶区在蛋白的 端，为 结 构 域（）（图，）。结构域呈现 交替折叠，螺旋将 折叠围绕在中间位置。在 螺旋的外侧靠近 结构域二聚化界面的地方还有一段来自蛋白 端的结构序列（，）（图）。二聚化界面以及底物结合口袋的结构特征 两个亚基的跨膜区之间相距较远，而 结构域相互靠近。由此来自不同亚基的 呈现交错状态，在其 端构成了一个二聚化的互作界面（图）。结构分析表明，的 端的疏水氨基酸（包括，和）、结构域中 和 之间的连接（）（包括 和），还有来自 和 的连接区（）的疏水氨基酸 共同在蛋白中间形成了一个较大的疏水核心区，介导二聚化作用。除此之外，在蛋白 结合区域，也有一个由、结构域 之前的环区（）和来自另一个亚基 结构域之前的环区（）组成的一个较小的二聚化疏水界面（图）。结构 端 第 期池希敏等：人源硫酸盐转运蛋白 的结构生物学研究 图 二聚化界面和底物结合分析。位于 附近的二聚化界面，主要由 和 上氨基酸组成的疏水核心介导 亚基二聚的相互作用；位于 的二聚化界面，主要由 和另一个亚基的 环区间的疏水作用介导；底物硫酸根结合位点附近的电子云密度图，主要作用氨基酸标注在了图上；参与介导底物结合的关键氨基酸；和；（：）的结构比较，可见底物结合位点非常相似；的硫酸根结合位点 在人源 家族旁系同源蛋白中的序列保守性分析。；，；（：），；的芳香环氨基酸 为疏水界面的核心，将 稳定在 结构域外侧位置，同时介导了在 结构域的亚基间互作。的 和 为两个特殊的跨膜螺旋，他们都只有半叶螺旋，另一半为解螺旋的环区结构。从细胞质一侧延展向胞外侧，而 正好相反，解开的螺旋相对排布，中间留出了一个空隙构成了 折叠转运蛋白的经典底物结合位点。在这附近有一个底物硫酸根（）的密度（图）。上的，上的，上的 以及 主链酮参与到硫酸离子的结合中（图）。与已经报道的；与底物硫酸根复合物结构的比较中，可以发现两者和硫酸根的结 合 非 常 相 似（图）。的 在；中保持不变，在；中被替换为性质相似的精氨酸。和 在；中的对应氨基酸虽然有变化，但仍然通过主链氨基与硫酸离子互作。唯一的区别发生在 的 位点，这个位点对应；的，在；中参与硫酸离子的结合。但由于其位于 螺旋区域和解螺旋区的交接面上，预计其突变成丙氨酸后仍然可能通过主链氨基进行硫酸离子的结合。另外，这些参与结合的氨基酸都位于核心结构域中，与其他 家族蛋白之前的发现一致。通过 家族旁系同源序列的比较可以看出，参与硫酸离子结合的氨基酸保守性较高。位苯丙氨酸除了在 中突变为苏氨酸之外，在其他同源蛋白中均为苯丙氨酸。而 位点除了在 中突变为缬氨酸之外，在其他同 电子显微学报 第 卷源蛋白中均为赖氨酸、精氨酸或者苏氨酸这类亲水性氨基酸。在目前已经报道有硫酸盐转运活性 的，和（）中均为酪氨酸。而通过主链参与离子结合的 位保守性则相对较差，从疏水氨基酸异亮氨酸到亲水的丝氨酸、苏氨酸均有出现（图）。处于朝内开口构象 折叠蛋白在构象变化时一般使用“电梯”模式完成转运的交替环路（）过程，即底物结合口袋位于核心结构域，并在转运过程中保持不变。通过核心结构域和门控结构域的相对运动，在转运循环中使得底物能分别接触到膜内外两侧。因此本工作将 的门控结构域和已经报道的哺乳动物 家族蛋白的门控结构域进行了对中，然后比较它们核心结构域的构象。可以发现 和 报道的构象最为相似，均处于朝细胞质侧开口的状态（图