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第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023人呼吸道合胞病毒感染性克隆构建及其验证宋晶晶，毛乃颖，李海，朱武洋，许文波，张燕*（国家卫生健康委员会 医学病毒和病毒病重点实验室，中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，世界卫生组织西太平洋地区麻疹/风疹参比实验室，北京 102206）摘要：人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus，HRSV）是引起全球婴幼儿急性下呼吸道感染的重要病原体。本研究旨在建立 HRSV 原型株 Long 毒株的反向遗传操作系统。通过利用细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome，BAC）为载体骨架构建 HRSV 的 Long 毒株全长质粒（LongBAC），以 pcDNA3.1 为载体构建分别表达 HRSV N、P、M21和 L蛋白（pcDNA3.1N，pcDNA3.1P，pcDNA3.1M21和 pcDNA3.1L）的四个辅助质粒，将五个质粒共转染于表达 T7 RNA 聚合酶的 BSR T7/9 细胞系进行病毒拯救。采用间接免疫荧光（Immune fluorescence assay，IFA）和测序方法对拯救的病毒进行鉴定，并评价其在细胞和动物水平的生物学特征。本研究首次成功构建以 BAC 载体为骨架的 HRSV 原型株 Long 感染性克隆，拯救的病毒在不同代数测序结果显示无突变，能够稳定传代，病毒滴度为 3106 PFU/mL；与实验室保存野生型 Long株（LongWT）相比具有相似的细胞生长动力学特性，在 1236h病毒呈指数增长，在 36h复制达到最高峰；在感染小鼠后能引起明显的肺部病理变化以及炎性相关细胞因子升高。本研究建立了高效、稳定的 HRSV 反向遗传学系统，为我国 HRSV 致病机制研究、疫苗和抗体药物研发提供技术平台。关键词：人呼吸道合胞病毒；反向遗传学；负链 RNA病毒中图分类号：R373.1 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02033410DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004286人 呼 吸 道 合 胞 病 毒（Human respiratory syncytial virus，HRSV）是引起婴幼儿急性下呼吸道感 染（Acute lower respiratory tract infection，ALRTI）最重要的病毒病原体。据估计，2019 年全球 5 岁以下儿童约 3 300 万感染 HRSVALRTI，其中 360 万例需住院治疗，导致超过 2.6 万例死亡病例1。全球 HRSV 暴发疫情时有发生27，严重影响公共卫生健康，但至今仍无批准的疫苗上市8。HRSV 属于肺炎病毒科，正肺病毒属，为非节段性单股负链 RNA 病毒，基因组全长约 15kb，包含 10个基因，编码 11种蛋白9。其中 N 蛋白、P 蛋白、M21蛋白和 L蛋白是病毒组装和出芽所不可或缺的结构蛋白。N 蛋白、P 蛋白和 L 蛋白与病毒 RNA 基因组 形 成 核 糖 核 蛋 白 复 合 体（Ribonucleoprotein complexes，RNP）。N 蛋白与病毒基因组紧密结合，为病毒 RNA 合成提供模板。L 蛋白作为依赖 RNA的 RNA 聚合酶，具有 mRNA 加帽和多聚腺苷酸化功能，参与病毒 RNA 的复制和转录10。P 蛋白与 N蛋白、M21 蛋白和 L 蛋白形成复合物，参与核衣壳和聚合酶的相互作用11，其中 M21 蛋白是一种转录延长因子，能防止转录过程过早终止和加强聚合酶转录终止信号以确保转录的连续性1214。目前，通过构建 HRSV 感染性克隆，广泛用以研究病毒的致病机制、新型病毒载体和减毒活疫苗研发等多种研究领域1519。对于 RNA 病毒，反向遗传学技术是以病毒 RNA 的 cDNA 来实现对病毒基因组的改造或修饰，通过对病毒基因组进行突变、删除或插入等改造，并拯救得到重组病毒20，21。本研究利用反向遗传技术以低拷贝细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome，BAC）载体为骨架首次成功构建了 HRSV Long 株的全基因组感染性克隆（LongBAC），同时构建参与 HRSV 基因组复制、病毒包装和出芽的四个结构蛋白（N、P、M21和 L 蛋白）作为辅助质粒，共转染于表达 T7 RNA聚合酶的细胞系中，拯救出 HRSV 的 LongBAC 毒株，并对拯救病毒株进行生物学特性的分析。本研究成功构建了 HRSV Long 毒株的反向遗传学系统，提供在 Long株基因组的基础上快速对其进行基因改造的条件，为下一步疫苗和抗体研发评估提供技术平台，也为今后 HRSV 结构与功能、致病机理和减毒活疫苗研究奠定基础。收稿日期：20221110；接受日期：20230111基金项目：国家重点研发计划（项目号：2017YFC1200303），题目：高等级生物设施重大事故模拟仿真与风险评估关键技术研究作者简介：宋晶晶（1994），女，从事病原生物学研究，Email：通讯作者：张燕（1975），女，研究员，从事病原生物学研究，Email：开放科学（OSID）2期宋晶晶，等.人呼吸道合胞病毒感染性克隆构建及其验证材料与方法1 毒株、质粒以及主要试剂HRSV 原 型 株 Long 株（Long WT）（ATCC VR26，保 存 于 25%的 蔗 糖）由 本 实 验 室 保 存；PBR322质粒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；pcDNA3.1（+）质粒由本实验室保存；BAC 质粒（浙江大学廖敏教授惠赠）；病毒 RNA 提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit（货号：52904）和无内毒素质粒大提试剂盒 EndoFree Plasmid Kit（货号：12362）购自 QIAGEN 生物有限公司；胎牛血清（货号：10099141C）购 自 北 京 赛 百 科 技 有 限 公 司；DMEM（货号：SH30243.01）北京鸿鹄志新生物科技有限公司；OptiMEM（货号：31985070）购自北京兆葵生物科技有限公司；Lipofectamine 3000（货号：L3000008）购自赛默飞世尔科技；PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2（Dye Plus）（货号：RR057A）购自 Takara 有限公司；qScript XLT OneStep RTqPCR ToughMix（货号：95132100）和 Sapphire芯片（货号：C14012）购自北京研威恒大基因科技有限公司；Mouse IL 5（货 号：1210502）、IL 10（货 号：1211002）、IL 6（货 号：1210602）、IL 1（货 号：1210122）、Mouse TNF ELISA kit（货 号：1217202）购自达科为生物技术有限公司；帕丽珠单抗 Palivizumab（货号：ATAD00024）由本实验室保存；FITC 标记抗人 IgG（货号：ZF0308）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。2 细胞和实验小鼠HEp2 细胞系由本实验室保存；BSR T7/9 细胞系（由中国疾病预防控制中心朱武洋教授惠赠）；68周龄雌性 BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物实验开展于中国疾病预防控制中心实验动物中心，动物实验均符合动物伦理（动物实验伦理编号：20220525058）。3 微型基因组的构建以 PBR322载体为基本骨架构建的微型基因组（PBR322RSVEGFP），用于验证辅助质粒表达蛋白的生物活性。PBR322RSVEGFP 从 5 端到 3端 包 括 T7 启 动 子、锤 头 核 酶（Hammerhead ribozyme，HHR）、Long株基因组片段（前导区序列、基因终止区序列、非编码区序列、基因起始区序列和尾随区序列）、增强绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）、丁 型 肝 炎 核 酶（Delta hepatitis enzyme，HDV）和 T7 终止子序列，质粒序列由南京金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成（图 1A）。将 PBR322RSVEGFP 质粒抽提后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。4 辅助质粒及 Long全长质粒的构建构建辅助质粒，对 Long 原型株（GenBank 号：AY911262）的 N、P、L 和 M21基因序列进行密码子优化并连接 pcDNA3.1（+）载体；以 BAC 载体为骨架构建 Long 全长质粒，在 BAC 质粒上的酶切位点BamHI 和 HindIII 处以 5 端至 3 端方向插入 T7 启动子、HHR、Long株全基因组序列、HDV 和 T7终止子序列。Long 全长质粒由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成（图 1B）。将四个辅助质粒与 Long全长质粒抽提后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。5 辅助蛋白功能验证根 据 QIAGEN 的 无 内 毒 素 质 粒 提 取 试 剂 盒EndoFree Plasmid Kit（货号：12362）说明书提取质粒，并使用 NanoDrop 紫外可见分光光度计测定质粒浓度。转染前一天将 BSR T7/9细胞均匀铺至六孔 板 中，第 二 天 至 密 度 为 70%80%，按 照 Lipofectamine 3000 试 剂 说 明 书 将 微 型 基 因 组PBR322 RSV EGFP（1.25 g）与 四 种 辅 助 质 粒pcDNA3.1N（1g）、pcDNA3.1P（1g）、pcDNA3.1M2 1（0.25g）和 pcDNA3.1 L（0.5g）共 转 染 至BSR T7/9细胞，置于 37 5%CO2培养箱培养 48h。辅助质粒提供 PBR322RSVEGFP 复制及转录所必 须 的 病 毒 蛋 白，可 在 荧 光 倒 置 显 微 镜 下 观 察EGFP的表达。6 病毒拯救提取包含基因组全长的 LongBAC 质粒，使用同 上 方 法 测 定 浓 度，细 胞 铺 板 方 法 同 5，按 照 Lipofectamine 3000 试 剂 说 明 书 将 LongBAC（2g）、pcDNA3.1 N（1.5 g）、pcDNA3.1 P（0.75g）、pcDNA3.1M21（0.25 g）和 pcDNA3.1L（0.4 g）共转染至 BSR T7/9 细胞，置于 37 5%CO2培养箱培养 57 d，盲传 3 代，观察细胞出现CPE 后冻融，随后在 4，450g 离心 5min，收集上清液，将上清液吸附 HEp2细胞 1h，1h后弃去上清液，用 PBS 清洗 3 次，加入 2%维持液（DMEM 培养基中加入 2%胎牛血清）置于 37培养箱培养 45 d，观察细胞病变情况，收集细胞冻融离心收集上清液后继续传代于 HEp2细胞。335病 毒 学 报39卷7 拯救病毒的间接免疫荧光（IFA）鉴定将 HEp2 细胞均匀铺至六孔板中，待细胞密度为 70%80%时，接种 LongBAC 毒株，吸附 1h 后弃去，PBS洗 3次；加入 2%维持液体培养 48h后，弃去维持液，PBS洗 3次；用预冷固定液（甲醇：丙酮比例为 1 1）固定 15min；5%脱脂奶粉封闭 1h，洗涤 3次；加入帕丽珠单抗（1 5 000 稀释于 5%脱脂乳中）在 37孵育 1h，洗涤 3 次；加入 FITC 标记的羊抗人IgG（1 400 稀释于 5%脱脂乳中）在 37避光孵育1h，洗涤 3次；倒置荧光显微镜下观察。8 拯救病毒稳定性鉴定分别将拯救的 LongBAC 毒株在 BSR T7/9 细胞培养的第 3 代，及在 HEp2 细胞传代培养的第 2代、第 5 代和第 10 代的上清用 QIAamp Vir