前胡醇提物对杨树桑黄液体发酵生产黄酮的研究_王锐丽.pdf

收稿日期：基金项目：河南省科技攻关项目（、）；河南省重大专项创新示范专项（）作者简介：王锐丽（），女，硕士，讲师，研究方向为微生物学。前胡醇提物对杨树桑黄液体发酵生产黄酮的研究王锐丽，杨立军，陈 琼（信阳农林学院制药工程学院，河南信阳）摘 要：以杨树桑黄为菌种，采用前胡醇提物发酵培养基生产黄酮。在单因素试验的基础上，以黄酮产量为考察指标，采用中心组合设计（）试验优化培养基配方。结果表明：最佳碳源为玉米粉，最佳氮源为麦芽浸粉；最佳培养基配方为玉米粉 、麦芽浸粉 、维生素 、；在发酵开始 后，添加质量浓度为 前胡醇提物到杨树桑黄发酵液中，获得黄酮产量为（），是优化前的 倍。关键词：杨树桑黄；前胡；中心组合设计；黄酮 ，（，）：,(),(),:;中图分类号：文献标志码：文章编号：（）桑黄（）作为珍稀的药用真菌，含有多糖、多酚、黄酮等多种药物活性成分，在中国古典中有多种药用记载，具有抗肿瘤、降血脂、抗病毒和提高免疫力等多种功效，在医药、保健食品、护肤品等领域具有广阔的应用市场。随着市场需求的不断增加及野生桑黄资源的不断减少，对桑黄进行规模化人工栽培势在必行。目前，通过椴木栽培和代料栽培的种植模式，我国已实现鲍姆桑黄（）、杨树桑黄和粗毛纤孔菌（）的规模化人工栽培。相比椴木栽培和代料栽培，液体发酵法因其原料稳定、质量易控、生长周期短、生产效率高等优点一直备受关注。外源物、前体物和不同中药的添加会影响药用真菌发酵过程中的代谢，能有效提升其生物活性成分的产量。等将香豆素作为黄酮合成的前体添加到桑黄发酵液中，桑黄能有效地利用香豆素，使得黄酮产量显著提高。目前，杨树桑黄因其具有产量高、易人工栽培、生物活性强等特点，已成为目前市场上流通较多的三大品种之一。如何有效地提高桑黄液体发酵产菌体生物量和黄酮产量，将是今后研究的重点。本研究采用单因素试验对其基本发酵培养基的碳源、年第 卷第 期 粮食与油脂氮源进行筛选，考察前胡醇提物的添加对桑黄黄酮产量的影响，并采用中心组合设计（）法对影响因子进行优化获得高产黄酮的培养基配方，为实现进一步大规模的桑黄深层发酵培养提供参考。材料与方法 材料与试剂杨树桑黄菌种，信阳农林学院制药工程学院微生物学实验室；前胡（经鉴定为白花前胡的根），市售；芦丁（纯度%）、葡萄糖、果糖、（）、乙醇，分析纯；去离子水，实验室自制。仪器与设备 超微量紫外分光光度计，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；型电热式高压灭菌锅，浙江新丰医疗器械有限公司；超纯水系统，苏州赛恩斯仪器有限公司；型高效离心机，贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司；型恒温恒湿培养箱，美墨尔特（上海）贸易有限公司；型全温摇床，杭州绿博仪器有限公司。试验方法 培养基灭菌 斜面培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、；种子液培养基：马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、；基础发酵培养基：葡萄糖、蛋白胨、，以上培养基于高压灭菌锅内 ，灭菌 ，备用。培养方法将在 斜面培养基上活化的杨树桑黄菌块（大约）转接入 种子液培养基中，置于全温摇床内 培养 后，将种子液以%的接种量接入 发酵培养基中，、培养 。用 层纱布减压过滤，收集菌体，用去离子水冲洗 次，于 烘干至恒重并称重，测定桑黄菌体生物量。前胡醇提物的制备 将前胡洗净后切片，真空干燥直至恒重，粉碎至粒径，备用。取 前胡粉末，加入 体积分数%的乙醇溶液，于 、振动频率 条件下超声处理 ，过滤后减压蒸馏除去乙醇，用去离子水配制质量浓度为 的前胡醇提物，再根据试验需求稀释成不同质量浓度。菌体内黄酮提取和产量测定参考文献进行菌体内黄酮提取及产量测定。以标准品芦丁质量浓度为横坐标，以用（）法在波长 下测定的吸光度为纵坐标。绘制标准曲线方程为 ，具有良好的线性关系。测定黄酮提取液的吸光度，通过标准曲线计算菌体内黄酮含量，菌体内黄酮产量计算见式（）。（）式中：为黄酮产量，；为菌体生物量，；为菌体内黄酮含量，。发酵条件的优化 碳源、氮源的筛选以发酵液体积为基准，分别添加 的果糖、糊精、玉米粉、麸皮粉到基础发酵培养基中替代葡萄糖，其他成分不变，按照 进行接种和培养，收集菌体测定黄酮产量，筛选最佳碳源。在此基础上，改变最佳碳源的质量浓度进行再发酵，以确定碳源的最佳添加量。同时，分别以 的硝酸铵、麦芽浸粉、酵母粉、黄豆粉替代基础发酵培养基中的蛋白胨，参照上述方法筛选最佳氮源并确定其添加量。醇提物质量浓度和添加时间的确定分别添加不同质量浓度的前胡醇提物到于基础发酵培养基中，按照 进行接种和培养，收集菌体测定黄酮产量，确定最佳醇提物质量浓度。其他条件不变，分别在发酵开始的第、天添加最佳质量浓度的醇提物到基础发酵培养基中进行再发酵，以确定醇提物的最佳添加时间。中心组合优化设计根据单因素试验结果，结合 （）的中心组合实验设计原理，选择玉米粉质量浓度（）、麦芽浸粉质量浓度（）、前胡醇提物质量浓度（）进行 因素 水平的响应面分析试验，以黄酮含量（）为响应值，选择 个中心点试表 中心组合因素设计及水平（）水平因素玉米粉质量浓度麦芽浸粉质量浓度前胡醇提物质量浓度粮食与油脂 年第 卷第 期验组以估计误差，星号臂长（）值为 ，因素设计及水平见表。数据统计分析单因素试验方差分析及图表制作使用 软件和 软件；采用 法检验差异显著性；使用 软件对试验数据进行二次回归拟合，模型建立及方差分析。结果与分析 发酵培养基中碳源和氮源的筛选 碳源种类对菌体生物量和黄酮产量的影响由图 可知：当玉米粉作为碳源时，菌体生物量和黄酮产量均明显高于其他 种碳源，分别达到（）、（）。等研究表明玉米粉等成分丰富的复合碳源有利于代谢产物的积累。因此，确定玉米粉作为最佳碳源。图 碳源种类对菌体生物量和黄酮产量的影响注：不同小写字母表示菌体生物量显著性差异（）；不同大写字母表示黄酮产量显著性差异（），下同。玉米粉质量浓度对菌体生物量和黄酮产量的影响图 玉米粉质量浓度对菌体生物量和黄酮产量的影响 由图 可知：随着玉米粉质量浓度的增大，桑黄菌体生物量和黄酮产量均呈现先上升后降低的变化趋势。当玉米粉质量浓度为 时，菌体生物量和黄酮产量均达到最大值，分别为（）和（）。因此，确定最适玉米粉质量浓度为 。氮源种类对菌体生物量和黄酮产量的影响由图 可知：当黄豆粉作为氮源时，菌体生物量明显高于其他 种氮源，生物量达到（）。当麦芽浸粉作为氮源时，黄酮产量达到最大，为（）。与无机盐硝酸铵相比，麦芽浸粉、酵母粉、黄豆粉这些有机氮更利于黄酮的积累。因此，确定麦芽浸粉作为最佳氮源。图 氮源种类对菌体生物量和黄酮产量的影响 麦芽浸粉质量浓度对菌体生物量和黄酮产量的影响由图 可知：随着麦芽浸粉质量浓度的增大，桑黄菌体生物量和黄酮产量均呈现先上升后降低的变化趋势。麦芽浸粉质量浓度为 时，获得的菌体生物量范围为（）（），变化趋势并不明显。当麦芽浸粉质量浓图 麦芽浸粉质量浓度对菌体生物量和黄酮产量的影响 年第 卷第 期 粮食与油脂度为 时，黄酮产量达到最大值，为（）。因此，最适麦芽浸粉质量浓度为 。前胡醇提物质量浓度对菌体生物量和黄酮产量的影响由图 可知：随前胡醇提物质量浓度的增加，桑黄菌体生物量和黄酮产量均呈现先增大后降低的变化趋势。当前胡醇提物质量浓度为 时，桑黄菌体生物量达到最大，为（），相比对照组（）提高了%。当醇提物质量浓度为 时，桑黄黄酮产量达到最大，为（），相比对照组（）提高了%。因此，确定最适前胡醇提物质量浓度为 。图 前胡醇提物质量浓度对菌体生物量和黄酮产量的影响 前胡醇提物添加时间对菌体生物量和黄酮产量的影响由图 可知：不同时间段添加醇提物，促进菌体生物量增大的变化趋势并不明显。在液体发酵已开始 后添加醇提物，黄酮产量达到最大，为（图 前胡醇提物添加时间对菌体生物量和黄酮产量的影响），相比于对照（）提高了%。从已发酵 以后再添加醇提物，黄酮产量呈明显下降趋势。因此，确定液体发酵进行 后再添加醇提物。中心组合优化试验结果及分析 中心组合设计及结果 试验设计及结果见表，方差分析结果见表。表 中心组合试验设计及结果试验号黄酮产量（）（）（）（）（）（）（）（）表 回归模型的方差分析因子方差汇总自由度方差平均值 值 值显著性模型 残余 失拟项 纯误差 总和注：表示差异极显著（）；表示差异显著（）。粮食与油脂 年第 卷第 期 应用 对表 的试验数据进行拟合，得到二次多项回归方程为 （）（）（）。由表 可知：回归模型 ，达到极显著水平；失拟项 ，不显著；决定系数 ，表明该模型拟合度良好；校正决定系数 ，表明大约有%的响应值（）变化可以用该模型进行解释。一次项、，二次项、和 对模型影响极显著，交互项影响显著，其余项影响不显著。利用 对所建模型进行参数优化，得出最佳参数为玉米粉质量浓度 、麦芽浸粉质量浓度 、前胡醇提物质量浓度 ，此时预测的最大桑黄黄酮产量为 。验证实验鉴于实验的实际操作性，修正液体发酵培养基中玉米粉质量浓度 、麦芽浸粉质量浓度 ，在发酵开始 后，添加质量浓度为 前胡醇提物继续进行生产黄酮发酵，取 次重复实验的平均值，得出桑黄黄酮产量为（），是优化前经基础发酵基获得的黄酮量（）的 倍，与模型预测值 非常接近，与预测值拟合度良好，说明上述模型能较好地预测桑黄液体发酵产生的黄酮含量。结论本研究为提高杨树桑黄菌体液体发酵生产黄酮化合物的能力，以菌体生物量和黄酮产量为考察指标，采用单因素试验和 试验对发酵培养基中碳源、氮源及前胡醇提物质量浓度进行优化。结果表明：优化后最佳培养基配方为玉米粉质量浓度 、麦芽浸粉质量浓度 、维生素 、；在发酵开始 后，添加质量浓度为 前胡醇提物到杨树桑黄发酵液中，获得黄酮产量为（），是优化前的 倍。说明 法可用来优化杨树桑黄菌丝体高产黄酮的培养基配方，将富含香豆素化合物的前胡添加到发酵液中，能明显促进桑黄生物量的增长及黄酮的合成，进一步大规模利用液体发酵生产桑黄黄酮提供一定的参考。参考文献 ,:,():昝立峰,包海鹰,李丹花“桑黄”类真菌中多酚物质及其生物活性研究进展 天然产物研究与开发,():曹红妹,胡桂萍,石旭平,等 药用真菌桑黄的研究进展 蚕业科学,():,():,():吴声华,戴玉成 药用真菌桑黄的种类解析 菌物学报,():陈万超,杨焱,张劲松,等 桑黄类真菌活性代谢产物的研究进展 食用菌学报,():,:王恺,丁志超,裴娟娟,等 碱提桑黄菌丝体多糖的抗氧化活性 食品工业科技,():,:程玉鹏,李欣虹,刘思佳,等 桑黄的药理作用研究进展 广东药科大学学报,():,:任思竹,史振霞,张艳霞,等 真菌桑黄的药用功效及栽培技术研究进展 安徽农业科学,():杨彩云,刘晓凤,王光强,等 响应面法优化提高桑黄 菌发酵法生产总三萜产率的研究 食品与发酵科技,():,檀鑫榕,陈舒婷,冉早红,等 桑黄菌发酵酱渣生产黄酮和蛋白质的培养基优化 食品研究与开发,():（下转第 页）年第 卷第 期 粮食与油脂一致。表 正交试验方差分析差异源平方和自由度均方 值显著性修正模型 截距 误差 总计 修正后总计注：表示差异极显著，；表示差异显著，。结论通过将淡竹叶用于饼干的开发，在单因素试验的基础上采用正交试验确定淡竹叶饼干的最佳配方：低筋小麦粉 、淡竹叶粉 、白糖、鸡蛋液 、小苏打 ，在此条件下制得的淡竹叶饼干，色泽浅绿，有竹叶清香，甜度适中，酥松香脆。本研究成果丰富了淡竹叶的应用，对淡竹叶在食品领域的利用具有一定的参考价值。参考文献 黄泽豪,蔡慧卿,郑丽香,等 中药淡竹叶的本草图文考 中药材,():尹爱武,田润,李探芳 淡竹叶茶营养成分分析 食品工业科技,():潘智然,王腾华,朱首伦,等 基于超高压液相色谱 高分辨多级质谱联用技术的中药淡竹叶化学成分分析 广东药学院学报,():,():,:王微宏,范俊源,周春山 淡竹叶及其水煎剂中氨基酸和微量元素的含量分析 湖南医科大学学报,():李学明,林善华,陈华龙 中药淡竹叶质量标准分析研究 北方药学,():,梁苍宇,刘小康,葛威,等 基于指纹图谱与化学计量法的淡竹叶药材质量评价研究 中药材,():王紫薇,涂明锋,叶文峰,等 淡竹叶黄酮提取工艺优化及抗氧化性研究 山东化工,():郭静,王浩然,沈周媛,