水解透明质酸锌的抗痤疮功效研究_陈帆.pdf

第 53 卷 第 2 期2023 年 2 月Vol.53 No.2Feb.2023165 日 用 化 学 工 业（中英文）China Surfactant Detergent&Cosmetics Hydrolysed zinc hyaluronan,a novel anti-acne candidateFanChen1,JunYang2,SupingYang3,YueWu1,*（1.Department of Research and Development,Bloomage Biotechnology Co.,Ltd.,Shanghai 200000,China;2.BIOHYALUX Business Division,Bloomage Biotechnology Co.,Beijing 100000,China;3.Department of Research and Development,Bloomage Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing 100000,China）Abstract:In this study,the effects of hydrolysed zinc hyaluronan（HA-ZN）on lipid production and skin hydration were revealed.The HaCaT and SZ95 cell lines were applied to evaluate the toxicity and beneficial effect of hydrolysed zinc hyaluronan.Pro-acne agents,arachidonic acid was used to induce the lipid production of SZ95 and the effect of hydrolysed zinc hyaluronan was detected.At the same time,in vitro antibacterial experiment against acne-related bacteria and the expression of skin hydration involved proteins were estimated.At the identical concentration of zinc ion,hydrolysed zinc hyaluronan exhibits less toxicity than zinc chloride,suggesting a higher safe dosage of zinc ion.In addition,hydrolysed zinc hyaluronan possesses the ability of alleviating lipid production in SZ95,as well as inhibiting the growth of Propionibacterium acnes and Malassezia furfur in vitro.The expression of AQP3 and HAS2 is also augmented in hydrolysed zinc hyaluronan treated group.The results indicate that hydrolysed zinc hyaluronan might be a promising drug candidate against acne vulgaris,averting the side effects of existing drugs such as dry skin.Key words:acne vulgaris;skin hydration;zinc salt;hydrolysed zinc hyaluronanReceived:July 21,2022;Revised:February 1,2023.*Corresponding author.E-mail:.DOI：10.3969/j.issn.1001-1803.2023.02.006HAS2AQP3HaCaT cellsSZ95 cellsHA-ZNLipidprodution50m166第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业（中英文）痤疮（Acne vulgaris）是最常见的皮肤疾病之一，以黑头、白头、粉刺、丘疹、脓疱、结节和囊肿为基本特征，好发于面部、颈部、上背部、肩部等区 域1。痤疮还会引起一系列的后遗症，例如色素沉着、疤痕等等，严重地影响患者的生理和心理健康，降低患者的生活质量2,3。痤疮的产生是多因素的，可由激素水平的改变、心理压力以及营养状况的改变等引起46。研究7表明，油脂的过度产生和其成分的改变是导致痤疮产生的主要原因之一。油脂是由皮脂腺分泌的非极性脂质的混合物，其主要的生理作用是覆盖于皮肤表面，起到维持皮肤水分，保持体温的作用8。然而，当皮脂腺受到一些例如炎症因子、雄激素等因子的刺激时，会导致其功能亢进，从而产生过多的油脂，进而导致痤疮的发生9。同时，过多的油脂给有害菌群的定殖和繁殖提供了一定条件。而这些有害菌群（例如痤疮丙酸杆菌和马拉色菌）的代谢产物也会引起皮肤的免疫反应，刺激单核细胞和其他细胞释放例如IL-1，IL1-，IL-6，IL-8，IL-12，TNF-等炎症介质，导致痤疮进一步加重，引发恶性循环10。尽管治疗痤疮有许多高效的药物，例如异维甲酸等，但是它们都存在着一定的副作用4。比如使用异维甲酸治疗痤疮会导致唇炎和皮肤干燥的产生等11，这可能是因为抑制了皮脂腺功能而导致的屏障功能受损。因此，开发一款安全、高效的治疗痤疮的化合物是极其重要的。锌作为辅因子参与了超过1 000种的生化反应，影响着细胞的生长和分化12。含锌的化合物通常被用作治疗皮肤疾病，尤其是抗痤疮的产品中。氯化锌软膏、氧化锌软膏常被作治疗痤疮，但因具有水溶性差的特点，所以其能添加的剂型较为局限。水解透明质酸锌（HA-ZN）是将透明质酸钠加入至含乙酸锌的乙醇置换液中，在一定pH条件下进行置换和水解反应，反应一定时间得HA-ZN粗品，随后进行洗涤、脱水、干燥即得HA-ZN产品。HA-ZN易于在水中分散，可应用的剂型范围较广。本文在人角质形成细胞系中比较氯化锌和HA-ZN的细胞毒性，并通过构建花生四烯酸诱导皮脂腺细胞（SZ95）产生油脂的模型，模拟由炎症因子刺激而产生的痤疮，利用油红对SZ95细胞中产生的油脂进行染色，检测HA-ZN对油脂生成的影响。利用体外抑菌实验，检测HA-ZN对痤疮丙酸杆菌和糠秕马拉色菌的抑菌作用。同时，利用角质形成细胞（HaCaT）对HA-ZN的保湿功能进行检测。以期探究HA-ZN的控油保湿的功效及其可能存在的机理。1 实验部分1.1 主要材料、试剂与仪器油红染色试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；DMEM培养基、胎牛血清，美国赛默飞世尔科技公司；异丙醇，上海泰坦科技股份有限公司；人皮脂腺永生化细胞（SZ95）、永生化人角质形成细胞（HaCaT），青旗（上海）生物技术发展有限公司；花生四烯酸、噻唑蓝，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；HAS2 antibody、AQP3 antibody，英国Abcam公司；HA-ZN，华熙生物科技股份有限公司。DMi1型光学显微镜、DM2500 LED型荧光显微镜，水解透明质酸锌的抗痤疮功效研究陈 帆 1，杨 君 2，杨素萍 3，吴 越 1,*（1.华熙生物科技股份有限公司 上海护肤品研发中心，上海 200000；2.华熙生物科技股份有限公司 个人消费品事业群，北京 100000；3.华熙生物科技股份有限公司 研发中心，北京 100000）摘要：探究了水解透明质酸锌（HA-ZN）在控油与保湿方面的体外生物活性。通过MTT法检测了不同质量浓度的HA-ZN对SZ95和HaCaT的细胞活性的影响，利用油红染色法检测HA-ZN对SZ95细胞内的油脂含量的影响，并且利用体外抑菌实验检测了HA-ZN的抑菌作用。同时，利用免疫荧光法检测HaCaT细胞中HAS2和AQP3表达的变化。结果表明，HA-ZN可以提升锌的安全用量。0.2 mg/mL和0.225 mg/mL的HA-ZN可以抑制SZ95细胞的油脂生成。5 mg/mL的HA-ZN可以抑制痤疮丙酸杆菌和糠秕马拉色菌的生长。同时，0.225 mg/mL的HA-ZN可促进HaCaT细胞表达HAS2和AQP3。HA-ZN具有较好的控油，抑制痤疮相关的菌群的作用，同时具有一定的保湿效果，提示其具有一定的抗痤疮的功效。关键词：痤疮；皮肤保湿；锌盐；水解透明质酸锌中图分类号：TQ658 文献标识码：A 文章编号：1001-1803（2023）02-0165-06167第 2 期开发与应用陈 帆，等：水解透明质酸锌的抗痤疮功效研究 德国Leica公司；MULTISKAN Sky型酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司。1.2 实验方法1.2.1 细胞毒性实验取HaCaT细胞或SZ95细胞用10%FBS DMEM培养基在T75的培养瓶里培养，待细胞密度约80%进行消化，接种于96孔板中，在37、5%CO2条件下培养备用。HA-ZN用水溶解、ZnCl2用DMSO溶解后用2%FBS DMEM稀释至测试浓度。24 h后吸掉上清液，加入制备好的样品及对照组，每孔200 L。置于37、5%CO2培养箱孵育24 h。吸弃上清，使用PBS洗一遍，每孔加入200 L质量浓度为0.5 mg/mL的MTT溶液孵育3 h。孵育完毕，弃上清，加入100 L DMSO，于550 nm处测定OD值。通过以下公式计算细胞活力（Cell viability）：1.2.2 油红染色测定细胞内脂质含量取SZ95细胞用10%FBS DMEM培养基在T75的培养瓶里培养，待细胞密度约80%进行消化，接种于24孔板种，在37、5%CO2条件下培养备用。24 h后吸掉上清液，加入制备好的样品及对照组，每孔1 mL，同时每孔加入50 mol/L的花生四烯酸。置于37、5%CO2培养箱孵育48 h。吸弃上清，使用PBS洗一遍，每孔加入300 L 4%的多聚甲醛固定15 min。弃上清，PBS洗一遍，使用油红染色试剂盒对细胞进行染色，染色完毕置于显微镜下拍照。然后使用异丙醇溶液溶解细胞内被染色的油脂，于500 nm处测定OD值。通过以下公式计算相对脂质含量（Lipid content）：1.2.3 HA-ZN抑菌功效测试本实验方法参考QB/T 27382012日化产品抗菌抑菌效果的评价方法。根据使用菌种的不同配制相应的培养基，然后灭菌。在无菌环境中，分别取糠秕马拉色菌和痤疮丙酸杆菌的24 h新鲜斜面培养物，用灭菌后的PBS冲洗后制备两种菌悬液备用，菌悬液要求浓度为：取0.1 mL菌悬液滴于5.0 mL PBS中，回收菌数为11049104。将HA-ZN使用无菌PBS稀释至5 mg/mL备用。吸取5 mg/mL HA-ZN溶液5.0 mL，放入灭菌试管中，20 恒温5 min。吸取菌悬液0.1 mL加入含5.0 mL样品的试管中，迅速混匀，并计时2，4和8 h。作用至设定时间后，取混合液0.5 mL加入含对照组OD值-溶剂对照OD值样品组OD值-溶剂对照OD值细胞活力（%）=100%对照组OD值-溶剂对照OD值样品组OD值-溶剂对照OD值相对脂质含量（%）=100%4.5 mL灭菌后的PBS的试管中，充分混匀。放置10 min后，吸取混合液1.0 mL置于灭菌后的平皿内，两种菌和3个时间均接种2个平行平皿。用凉至4045 的琼脂培养基15 mL作倾注，转动平皿使其充分混匀，待琼脂凝固后翻转平皿，根据菌种的培养温度置于恒温培养箱中，培养48 h后做活菌菌落计数。使用PBS代替样品，同时按以上步骤操作，作为对照样品。实验重复3次，求平均值后计算抑菌率。