水溶性富勒烯的安全性评价及其在化妆品中的应用_黎小青.pdf

2023年 第4期广东化工第50卷 总第486期71水溶性富勒烯的安全性评价及其在化妆品中的应用水溶性富勒烯的安全性评价及其在化妆品中的应用黎小青，刘雅玲，韩鄂宁，张婧芳(厦门福纳新材料科技有限公司，福建 厦门361115)摘要通过对水溶性富勒烯进行急性经皮毒性试验、皮肤变态反应试验、皮肤刺激性/腐蚀性试验、皮肤光毒性试验、急性眼刺激/腐蚀性方面的安全性评价，验证了水溶性富勒烯是一种极具安全性的化妆品原料，无皮肤变态反应、无皮肤和眼刺激性/腐蚀性、无皮肤光毒性的低毒性物质，具备开发成化妆品原料具有的基础安全性。关键词水溶性富勒烯；安全性；化妆品中图分类号TQ文献标识码A文章编号1007-1865(2023)04-0071-04Safety Evaluation of Water-soluble Fullerenes and their Application in CosmeticsLi Xiaoqing,Liu Yaling,Han Ening,Zhang Jingfang(Xiamen Funano New Material Technology Co.,Ltd.,Xiamen 361115,China)Abstract:Through the safety evaluation of water-soluble fullerenes in acute transdermal toxicity test,skin allergy test,skin irritation/corrosion test,skinphototoxicity test,acute eye irritation/corrosion,the water-soluble fullerene was verified.Fullerene is a very safe cosmetic raw material.It has no skin allergy,noskin and eye irritation/corrosion,and no skin phototoxicity.It has the basic safety of being developed into a cosmetic raw material.Keywords:water-soluble fullerenes；safety；cosmetics富勒烯是世界上被发现的第三种碳的同素异形体，是1985年由克罗托、科尔和斯莫林三位科学家发现的，他们因此获得了1996年的诺贝尔化学奖1。1990年克利斯莫(Kriischmer)等人第一次报道了克级合成富勒烯C60的方法，从此开启了C60的大量研究。对C60的研究涉及到多个领域，包括生物医药、分子手术刀、有机太阳能电池、润滑油、化妆品2-5等。富勒烯的结构都是以五边形和六边形组成的凸多面体，目前应用最广的C60的分子结构为球形32面体，具有60个碳原子由20个六元环和12个五元环连接而成，具有30个碳碳双键，组成了形似足球的空心对称分子6。双键的存在是影响富勒烯化学性质的主要结构特征，特别是它们可以参与加成反应。由于这种反应因此，碳笼的外球可以进行修饰，含有各种官能团的衍生物可以被合成7。富勒烯在水中的溶解度很低(小于1 pg/mL)，而富勒烯很多的应用需要水相分散体因此探索富勒烯的水溶性具有特殊的意义，通常使用特殊的增溶剂来制备，如表面活性剂，水溶性聚合物，如聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，受体分子，如钙芳烃，和多糖、环糊精、淀粉和羧甲基纤维素8等。当暴露在紫外线或可见光下时，富勒烯表现出氧化性能，并能产生各种活性氧形式。富勒烯是一种强大的光敏剂，它能够将三重态氧转化为活性单线态氧。富勒烯的另一个重要特性是能够以双键结合自由基。因此，Krusic等人研究发现一个富勒烯碳60分子可以结合多达34个甲基自由基，由于这种特性，富勒烯被称为“自由基海绵”9，通常作为抗氧化剂应用。在开发富勒烯的应用时毒性是一个必须要考虑的问题。富勒烯及其衍生物在生物系统中的吸收、分布、代谢和排泄方面的研究还在初期阶段。从现有的研究中可以得出一些结论：以静脉注射和口服方式给予富勒烯后，富勒烯的吸收有限，可以通过粪便和尿液快速排出体外。另有研究表明，小鼠口服剂量2000mg/kg的富勒烯没有显示明显毒性10。富勒烯的毒性与纯度有很大关系，Kolosnjaj认为富勒烯没有明显毒性11，Moussa也认为纯富勒烯是没有毒性的12。本文对公司改造的水溶性富勒烯进行安全性验证，探索水溶性富勒烯应用在化妆品的可能性。1试验试验1.1主要试剂与仪器试剂：水溶性富勒烯(产品名富勒烯原液)(厦门福纳新材料科技有限公司)、8-甲氧基补骨脂(TCL)、玉米油(鲁花)仪器：液相色谱仪、电子天平、动物培养箱、光源(天津开发区合普工贸有限公司)实验动物：SPF级SD大鼠，斯贝福(北京)生物技术有限公司提供(生产许可证：SCXK(京)2019-0010)、普通级Hartley豚鼠、普通级日本大耳白兔，北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供(生产许可证：SCXK(京)2020-0002)、动物饲料购自 北 京 科 澳 协 力 饲 料 有 限 公 司(产 品 许 可 证 号：SCXK(京)2019-0003)1.2实验方法1.2.1富勒烯原液(AF)的制备称取11.25 g富勒醇溶解于10 mL蒸馏水中形成富勒醇水溶液，将其置于70水浴锅中，在水浴加热过程中分多次缓慢加入黄原胶，加入过程持续搅拌，加入黄原胶总量为9 g。待黄原胶完全溶解后定溶至15 mL，溶液中加入丁二醇85 mL，在70水浴中搅拌3 h后取出冷却即得富勒烯原液(AF)。1.2.2急性经皮毒性试验参考 化妆品安全技术规范(2015年版)13选用SPF级SD大鼠进行急性经皮毒性试验，采用限量法，即按照2180mg/kgBW的给药剂量，对供试大鼠(雌、雄各5只)一次性经皮给予样品。试验开始前24 h，剃除动物躯干背部拟染毒区域的被毛，不要损伤皮肤以免影响皮肤的通透性。实验当日称重、标记，根据动物体重确定涂皮面积。将样品均匀涂敷于动物背部皮肤染毒区，然后用一层薄胶片覆盖，无刺激胶布固定，防止动物舔食。封闭接触24 h，给药后24 h内密切观察动物体征。待染毒结束注意立即清除残留样品。每天观察1次，连续观察14天。并每周记录大鼠中毒体征、记录症状出现和消失时间，及动物死亡时间。动物每周称重、结束观察日存活动物称重，处死后动物进行大体解剖学检查。1.2.3皮肤变态反应试验参考化妆品安全技术规范(2015年版)选用300400 g普通级豚鼠30只进行皮肤变态反应试验。给予受试物前约1天，剃除豚鼠背部左测毛发约46 cm2。诱导接触：将约0.2 mL受试物涂在实验动物去毛部位，并覆盖二层纱布和一层玻璃纸，再敷上无刺激胶布，封闭固定6 h。阴性对照组不做处理，阳性对照组涂以诱导浓度的2,4-二硝基代苯溶液做同样处理。第7 d和第14 d以同样方法重复一次。激发接触：末次诱导后14 d，将约0.2 mL的受试物涂于豚鼠背部右侧2 cm2 cm去毛区(接触前24 h脱毛)，然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布固定6 h.阴性对照组和阳性对照组分别以受试物原样和激发浓度的2,4-二硝基代苯溶液做同样处理。激发接触后24 h和48 h观察皮肤反应，并按化妆品安全技术规范(2015年版)皮肤变态反应实验评分标准进行评分。如动物皮肤反应积分2时，判为该动物出现变态反应阳性，最后判定受试物的致敏强度。1.2.4皮肤刺激性/腐蚀性试验参考化妆品安全技术规范(2015年版)选用23 kg普通级日本大耳白兔4只进行皮肤刺激性/腐蚀性试验。试验前24 h，将动物背部脊柱两侧毛剔除，不得损伤皮肤，去毛范围收稿日期2022-08-17作者简介黎小青(1987-)，女，福建龙岩人，硕士研究生，主要研究方向为富勒烯的应用。广东化工2023年 第4期第50卷 总第486期左、右约3 cm3 cm。取受试物原样作用在左侧皮肤上，面积约2.5 cm2.5 cm，每天1次，连续14天，右侧皮肤为对照。从第二天开始，每次试验前去毛，用水清洗除去残留受试物，对照区和试验区作同样处理。1 h后观察结果，按照化妆品安全技术规范(2015年版)进行评分，实验结束后计算每天每只动物的平均积分，根据积分均值判定皮肤刺激程度。1.2.5皮肤光毒性试验参考化妆品安全技术规范(2015年版)选用300400 g普通级豚鼠12只雌雄各半，随机均分为试验组和阳性对照组进行皮肤光毒性试验。平均光强度和照射时间：强度的测定：皮肤光毒性实验仪使用前，在实验动物背部照射区设6个点测定光强度(mW/cm2)，以平均值计。本实验条件下，光强度平均值约为7.280 mW/cm2。照射时间计算：照射剂量为10 J/cm2，按如下公式进行计算：照 射 时 间(sec)=照 射 剂 量(10000 mJ/cm2)/光 强 度(mJ/cm2/sec)本实验条件下，照射时间为1374秒。试验前动物适应饲养环境3天。进行正式光毒性试验前1824 h，剃除动物脊柱两侧皮肤毛发，需保持皮肤完好无损伤及异常。按化妆品安全技术规范(2015年版)P501图1备4块去毛区，每块去毛面积约为2 cm2 cm。将动物固定，在动物去毛区1和2涂敷0.2 mL受试物，30 min后，左侧(去毛区1和3)用铝箔复盖，胶带固定，右侧(去毛区2和4)用UVA进行照射。结束后分别于1，24，48，和72 h观察皮肤反应，根据化妆品安全技术规范(2015年版)判定每只动物皮肤反应评分。1.2.6急性眼刺激性/腐蚀性试验参考化妆品安全技术规范(2015年版)选用23 kg普通级日本大耳白兔3只进行急性刺激性/腐蚀性试验。在试验开始前的24 h内对试验动物的两只眼睛进行检查，所选动物均为无眼刺激症状、角膜缺陷及结膜损伤。试验时将受试物0.1 mL，分别滴入3只白兔左眼结膜囊中，使上、下眼睑被动闭合1 s，右眼作自身空白对照。给予受试物后取1 h、24 h、48 h、72 h、4 d、7 d六个时间点对动物进行眼睛检查，如果72 h眼睛检查未出现刺激反应，即可终止试验。于24 h观察和记录结束之后，对所有动物的眼睛应用荧光素钠作进一步检查，按化妆品安全技术规范(2015年版)急性刺激性/腐蚀性试验中评分标准进行评分，根据24 h、48 h、72 h各个观察时间点的刺激反应的最高积分均值和恢复时间评价，判定受试物对眼的刺激强度。2结果与讨论结果与讨论2.1急性经皮毒性试验试验结果观察：实验动物未出现明显中毒体征。动物死亡及体重记录见表1，大体解剖学检查未见异常。根据化妆品安全技术规范(2015年版)判定标准表明：在本试验条件下，样品对雌、雄大鼠的急性经皮半数致死剂量(LD50)均大于2180 mg/kg BW，依据皮肤毒性分级标准，AF属于低毒性物质。表表1急性经皮毒性试验结果急性经皮毒性试验结果Tab.1Results of acute percutaneous toxicity tests剂量/(mg/kg BW)性别试验前/g(动物数)第7天/g(动物数)第14天/g(动物数)死亡动物数/只2180雌285.06.8(5)308.36.0(5)330.13.5(5)02180雄293.54.9(5)340.15.3(5)379.86.8(5)02.2皮肤变态反应试验结果分析根据化妆品安全技术规范(2015年版)，对豚鼠皮肤变态反应试验结果如表2，对其结果进行判定，AF对豚鼠皮肤刺激后未见皮肤变态反应。表表2对豚鼠皮肤变态反应试验结果对豚鼠皮肤变态反应试验结果(BT法法)Tab.2Results of guines pig skin allergy test(BT method)组别阴性对照受试物组阳性对照动物数/只102010起始体重/g353.15.2351.56.6349.56.2终止体重/g531.811.1509.314.0