双去甲氧基姜黄素通过PI3...的溃疡性结肠炎小鼠炎症反应_吴慧欢.pdf

现代消化及介入诊疗2022 年 第27 卷 第12 期Modern Interventional Diagnosis and Treatment in Gastroenterology 2022，Vol27，No121527基础研究双去甲氧基姜黄素通过 PI3K/AKT 信号通路抑制DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠炎症反应吴慧欢1，2，卓泽伟2，杨颀2，陈浩1，2，沙卫红1，2【摘要】目的利用 DSS 诱导的溃疡性结肠炎模型探讨双去甲氧基姜黄素对溃疡性结肠炎的炎症反应的调控及其与PI3K/AKT 信号通路的相关性。方法6 8 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠 18 只，分为正常组，模型组，双去甲氧基姜黄素(50 mg/kg)。观察各组小鼠的临床表现、体重及生存时间情况;HE 染色观察各组小鼠结肠组织病理损伤情况;QPC 方法检测各组小鼠结肠组织相关炎症因子 TNF-，IL-1，IL-6，MCP-1 的表达水平。WB 方法检测各组小鼠结肠组织 p-P13K，P13K，p-AKT，AKT蛋白的表达水平。结果与模型组相比，双去甲氧基姜黄素干预组体重下降明显减轻，生存时间延长;HE 染色显示与模型组对比，双去甲氧基姜黄素干预组炎性浸润细胞减少，腺体结构较完整;QPC 结果显示与模型组相比，双去甲氧基姜黄素干预组炎症因子 TNF-，IL-1，IL-6，MCP-1 的表达水平明显下降。WB 结果显示，与模型组比较，双去甲氧基姜黄素干预组小鼠结肠组织 p-P13K，p-AKT 蛋白表达水平下降，P13K，AKT 蛋白表达水平无明显差异。结论双去甲氧基姜黄素可能通抑制 PI3K/AKT 信号通路，减轻 DSS 诱导的小鼠 UC 的炎症反应。【关键词】溃疡性结肠炎;双去甲氧基姜黄素;炎症因子;PI3K/AKT 信号通路中图分类号:574文献标志码:ADOI:10 3969/j issn 1672 2159 2022 12 008作者单位:1 510006 华南理工大学医学院;2 510080 广东省人民医院(广东省医学科学院)消化内科通信作者:沙卫红，E-mail:shaweihong gdph org cn基金项目:国家自然科学基金资助(82170561);广东省自然科学基金资助(2022A1515012081)Bisdemethoxycurcumin suppresses DSS-induced inflammatory response in ulcerative colitis mice via the PI3K/AKT signalingpathwayWU Hui-huan1，2，ZHUO Ze-wei1，YANG Qi1，CHEN Hao1，2，SHA Wei-hong1，21 School of Medicine，South China University of Technology，Guangzhou 510006;2 Department of Gastroenterology，GuangdongProvincial Peoples Hospital，Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangzhou 510080【Abstract】ObjectiveThe modulation of bisdemethoxycurcumin in ulcerative colitis and its relationship to PI3K/AKT signalingpathway were examined using a DSS-induced ulcerative colitis model MethodsEighteen male C57BL/6J mice at 6 8 weeks of agewere divided into normal group，model group，and bisdemethoxycurcumin group(50 mg/kg)The clinical feature，changes of bodyweight and survival time of each group were observed Histopathological damage to the colon of mice in each group was observed by HEstaining QPC assay was applied to detect the expression levels of inflammatory factors TNF-，IL-1，IL-6，MCP-1 The expressionlevels of p-P13K，P13K，p-AKT and AKT in colon tissue of each group were detected by WB esultsCompared with the modelgroup，the bisdemethoxycurcumin intervention group significantly reduced weight loss and prolonged survival time HE staining showedfewer inflammatory cells and more intact glandular structures in the bisdemethoxycurcumin intervention group compared to the modelgroup The QPC results showed that the expression levels of inflammatory factors TNF-，IL-1，IL-6 and MCP-1 were significantlydecreased in the bisdemethoxycurcumin intervention group compared with the model group WB results showed that compared with themodel group，the expression level of p-P13K and p-AKT in colon tissue of mice in the bisdemethoxycurcumin intervention group wasdecreased，while the expression level of P13K and AKT was not significantly different ConclusionBisdemethoxycurcumin mayattenuate the DSS-induced inflammatory response in ulcerative colitis by inhibiting the PI3K/AKT signaling pathway【Key words】Ulcerative colitis;Bisdemethoxycurcumin;Inflammatory factors;PI3K/AKT signaling pathway溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种消化系统的顽固性疾病，其发病机制往往与环境、遗传、肠道微生态等因素引起的氧化应激和免疫反应失衡有关1。UC 常表现为腹痛、慢性或亚急性腹泻、黏液脓性血便等，严重影响患者身心健康2。目前，5-氨基水杨酸、类固醇、免疫抑制剂和生物制1528现代消化及介入诊疗2022 年 第27 卷 第12 期Modern Interventional Diagnosis and Treatment in Gastroenterology 2022，Vol27，No12剂是临床治疗 UC 的主要方法，但目前药物治疗具有局限性，如副作用大，经济负担重等3 4，因此，针对 UC 治疗药物的开发是十分有必要的。双去甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin，BDMC)，是从中药材姜黄的根茎中提取的一种天然有效成分5。有研究表明，与姜黄素一样，BDMC 具有抗炎6、抗氧化5，7、抗肿瘤8、抗纤维化9 等多种药理作用。此外，与姜黄素相比，BDMC 在同等生物条件下稳定性强，生物利用度高7，10。然而，目前关于 BDMC 对 UC 的影响研究报道尚少，其潜在机制尚不清楚。因此，本研究旨在通过体内实验探讨 BDMC 对UC 的治疗作用并进一步探讨其潜在的作用机制，为 BDMC应用于临床 UC 的治疗提供理论基础。1材料与方法1 1实验动物、试剂SPF 级 C57BL/6J 雄性小鼠，6 8 周龄，体重 18 22 g，购自广州锐格生物科技有限公司(动物生产许可证号:SCXK 粤 2021 0059)，饲养于华南理工大学动物实验中心。双去甲氧基姜黄素(Macklin 公司，B860707);葡聚糖硫酸钠盐(Meilunbio 公司，MB5535-1);E Z N A Total NA Kit I(Omega 公司，6834-01);TB Green Premix Ex Tap (Takara公司，820A)，PrimeScript T Master Mix(Akara 公司，036A);BCA 蛋 白 检 测 试 剂 盒(Thermo Fisher 公 司，23227);HP 底物 ECL 高敏试剂盒(Abbkine 公司，K22020);小鼠 TNF-、IL-1、IL-6、MCP-1、GADPH 引物购自广州天一辉远基因科技有限公司。p-P13K、P13K、p-AKT、AKT 抗体购自 Cell Signaling Technology 公司(批号 4228T、425T、4060 T、4691T)。1 2方法1 2 1UC 模型构建所有小鼠适应性喂养 3 天后，随机分为正常组(Control)，模型组(DSS)，双去甲氧基姜黄素组(DSS+BDMC)。除正常组外，其余各组均给予含 3%DSS 的生理盐水饮用，连续 7 天，第 8 天更换为生理盐水正常饮用 3天。造模的同时开始 BDMC 50 mg/kg 给药，连续 10 天。期间观察并记录各组小鼠的临床表现及体重变化情况。此外，我们依据动物福利指南，认为小鼠体重下降达 20%及以上为该小鼠死亡11。1 2 2HE 染色评价小鼠结肠病理改变第 10 天末次给药后，禁食不禁水，颈椎脱臼处死小鼠，剪取部分结肠组织，用预冷的磷酸盐缓冲液反复冲洗干净后 4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，苏木素 伊红染色，进一步行结肠组织病理分析。1 2 3QPC 法检测小鼠结肠组织炎症因子水平取部分结肠组织，根据试剂盒说明书进行总 NA 的提取及 cDNA 的合成，并以合成的 cDNA 作为扩增模板。炎症因子包括 TNF-，IL-1，IL-6，MCP-1。引物详细序列见表 1。表 1引物序列基因名称上游引物下游引物IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAGAGTGGTATAGACAGGTCTGTTGGMCP-1CTGTGCTGACCCCAAGAAGGAGGTGGTTGTGGAAAAGGTAGTGIL-1ATGCCACCTTTTGACAGTGATGTGATGTGCTGCTGCGAGATTTNF-CGACGTGGAACTGGCAAGAAGGACCGATCACCCCGAAGGAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA1 2 4WB 法检测小鼠结肠组织 p-P13K，P13K，p-AKT，AKT蛋白的表达水平取部分结肠组织，用预冷的 PBS 洗涤 3次，加入适量的 IPA 进行组织机械匀浆取上清，用 BCA 法测蛋白浓度，95 水浴 5 min 使蛋白变性，使用 10%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离蛋白后转移