嗜热紫硫细菌RuBisCO的冷冻电镜结构研究_常圣海.pdf

第 卷 第 期 年 月电 子 显 微 学 报 ，文章编号：（）嗜热紫硫细菌 的冷冻电镜结构研究常圣海，张 兴，陈景华（浙江大学冷冻电镜中心，浙江 杭州；浙江大学医学院附属邵逸夫医院，浙江 杭州；浙江大学生命科学学院，浙江 杭州）摘 要 ，二磷酸核酮糖羧化酶 加氧酶（，）能够催化光合作用暗反应过程中 的同化过程，完成生物圈中 的碳固定。然而 的催化效率极低，每个 全酶每秒钟只能催化 个 分子的转化，高温环境下，高等植物中 的催化活性会更低。全球暖化环境下，获取高温环境下具有较高催化活性的 突变体，既能增加作物产量，又可固定更多，减缓全球暖化速度。本研究利用冷冻电镜技术获取了嗜热紫硫细菌 的精细三维结构，并分析其与其他物种 结构上的异同，对设计高温环境下具有较高催化活性的 突变体提供了基础。关键词 ；嗜热紫硫细菌；冷冻电镜中图分类号：；文献标识码：收稿日期：；修订日期：基金项目：浙江大学实验技术研究项目（）；国家自然科学青年基金资助项目（）；国家重点研发计划项目（，）作者简介：常圣海（），男（汉族），河南人，助理研究员：通讯作者：陈景华（），男（汉族），陕西人，研究员：光合作用是地球上最重要的生化过程，向大多数生物提供物质基础和能量来源。光合作用包括光反应和暗反应两个阶段，其中，在暗反应过程中，催化五碳糖底物，二磷酸核酮糖（）羧化生成两个 磷酸甘油酸分子，将大气中的 转换有机碳，完成碳的固定。鉴于 的重要作用，其结构和功能已经被广泛和深入的研究。已知的 包含四种类型，其中 型为自然界中丰度最高，广泛分布在光合细菌和高等植物中，约占生物圈中蛋白干重的 以上，催化绝大部分的碳固定过程。型 是由 个大亚基（）和 个小亚基（）组成的复合体。该复合体呈 对称，由四个 二聚体围绕四次轴排列，两端各有四个，其合成和组装 需 要 一 系 列 的 分 子 伴 侣，包 括 和 积累因子（）。二聚体界面形成两个催化口袋，全酶包含 个催化口袋；不直接参加催化反应，但能够调控全酶的催化活性。天然 的催化效率极其低下，是光合作用固定 的限速步骤。对 进行工程化改造，提高其固碳效率和反应特异性，对于提高农业作物产量和实现碳中和目标均具有重要意义。高等植物中，环境温度提高，的催化活性显著降低。随着全球暖化效应的日趋严重，设计和筛选高温环境下具有高催化效率的 突变体日趋重要。目前尚无嗜热光合细菌 的超高分辨结构报道，只是在绿硫细菌中获得了 的结构，不能 固 定。基于此，本工作拟通过获取高热环境生物中 结构，以期望揭示其高温环境下独特的工作机制。嗜热型紫硫细菌 （）分离于日本长野县的温泉中，是一种非产氧的光合细菌，该细菌的最佳生长温度约为。获取 的 高分辨结构，对于进一步设计高温环境下具有高催化活性 具有重要的借鉴意义。本研 究 利 用 冷 冻 电 镜 技 术 对 紫 硫 细 菌 的 进行三维重构，并与其他物种的 进行比较，探索高温环境下 催化碳固定的结构基础和分子机制。材料与方法 的纯化 细胞在 培养箱中厌氧生长 天。收集 细胞，离心，沉淀用 缓冲液（，；电子显微学报 第 卷）重悬，加入 混合后置冰上预冷 。将样品置冰上使用超声波破碎仪进行菌体破碎。破碎浆液 ，离心 ，弃沉淀，上清 ，超速离心 。超速离心后取上清，用 的滤膜过滤后进行阴离子交换柱层析（蛋白纯化系统）。柱层析填料为 （），样品上样后先用 缓冲液洗脱 个柱体积，再使用 缓冲液梯度洗脱 个柱体积，收集合并 缓冲液洗脱下来的样品，使用 超滤管对样品进行浓缩（，）。先后用 和的硫酸铵沉淀样品，将 硫酸铵沉淀的样品用少量 缓冲液（，）重悬，上样进行第二次阴离子交换柱层析（蛋 白 纯 化 系 统），使 用 缓冲液梯度洗脱 个柱体积。收集第一个洗脱峰，样品进行浓缩后进一步采用凝胶过滤层析分离。凝胶过滤层析柱型号为 （公 司），柱 体 积 ，缓 冲 液 为，；。收 集 主 峰 样 品，使 用 超 滤 管（）超滤浓缩（，）即可得到高纯度 样品。冷冻样品制备 （）载网的处理：使用（）对载网（目）进行辉光处理，使载网表面亲水化，以便样品能均匀的铺在载网表面，辉光电流强度设置为 ，辉光处理时间为。（）设置 （赛默飞）冻样参数：温度为 ，相对湿度为，为，为 ；取 浓度为 的标准蛋白样品加到载网上，按照设置好的 冻样流程操作，最后将载网快速冷冻在液态乙烷里。数据收集 （）设备：冷冻电镜（，赛默飞）；直接电子探测器（，）。（）自动收集软件：。（）收集模式：放大倍数为 倍，对应像素大小为 ；单电子计数模式，电子束斑强度为 ，曝光 ，总剂量为 ；每张数据包含 帧，每帧曝光时间为 。数据处理 使用 程序对每张图片进行漂移矫正，使用 对矫正后的图片进行衬度传递函数的测定。使用 和 软件完成后续的数据处理。在 中使用 在 张照片中挑出 个颗粒，然后使用 进行第一次 分类，筛选得到 个颗粒；接着使用 对这些颗粒进行额外的两次 分类，最终得到 个颗粒。使用这些颗粒，加上 对称轴，得到 分辨率的 三维重构结果，具体流程如图 所示。模型搭建 使用 软件，将蓝细菌的原子模型（：）对齐到获得的 密度图里，然后使用 软件手动进行模型替换和编辑，获得紫硫细菌的原子模型。然后使用 软件优化获得的原子模型，再使用 软件进行手动调整，获得准确的 原子模型，相关模型搭建参数如表 所示。表 三维重构及模型搭建相关参数统计表 参数名称参数值数据收集电镜 加速电压 探测器 像素大小 电子剂量（）欠焦范围 收集照片数目 三维重构软件 对称性所使用的颗粒数，分辨率 密度图锐化温度因子（）优化相关参数软件残基数 配体 键长偏差 键角偏差（）图统计 良好 允许不允许 实验结果 使用冷冻电镜技术，最终得到了 分辨率的紫硫细菌 三维结构。在冷冻电镜密度 第 期常圣海等：嗜热紫硫细菌 的冷冻电镜结构研究 图 紫硫细菌 的冷冻电镜单颗粒三维重构。的典型冷冻电镜照片；单颗粒三维重构流程；角度分布图；单颗粒三维重构的 曲线。；图中，能够清晰地识别芳香族氨基酸残基，如图 和图 中所示，该结果表明本研究中所获得的 三维结构重构分辨率优于 。的整体结构 总体而言，该结构与先前确定的 酶结构显示出高度相似性。该复合体呈现 对称，四个 大 亚 基（）和 小 亚 基（）组成的 四聚体围绕 次轴排列，形成一个 元复合体（图），这与细菌和高等植物的 型 的结构相同。包括一个 端结构域（残基）和一个 端结构域（残基）（图）。端结构域的核心由 股 链折叠组成的平行片层和两个螺旋组成；端结构域由包含一个 股 链和 个螺旋组成的折叠桶单元和一个螺旋组成的帽子结构。端结构域内的四个保守残基（、和）与相邻 末端结构域中桶状结构的残基（、）一起组成活性中 电子显微学报 第 卷心。核心由一个 股 链折叠和 个螺旋组成（图），这是一个高度保守的整体折叠。不参与活性中心的形成。图 紫硫细菌 的三维结构。的整体电势分布密度图和已经 好的结构卡通图，彩色部分显示为 全酶整体结构的四分之一；单个复合体的结构模型，图左黄色虚线框标注的为底物结合口袋；图右黄色部分为 的 端结构域，蓝色部分为 的 端结构域，紫色部分为；结 构模型图；，端结构域的部分电势密度图。，；，；，紫硫细菌 与其他物种 的区别 将紫硫细菌的 的结构与来自蓝细菌、莱茵藻和拟南芥的 结构进行叠加对比发现，整体结构相似，活性位点保守，然而其也包含一些特有的结构。从紫硫细菌得到的 活性位点与莱茵衣藻 的活性位点相同，未发现镁离子和底物（图），表明得到的 处于 构象。根据序列比对结果，紫硫细菌 与其他三种 具有高度相近序列，但紫硫细菌的 端 较短，缺失约十个氨基酸残基（图）。在蓝细菌中，相关研究表明 端的这些氨基酸残基能够被 羧化激活酶（，）识别并结合，从而修复活化 的催化活性，同时也并未在紫硫细菌中比对到 的同源序列。紫硫细菌 与其他物种 的区别 紫硫细菌的 结构与来自蓝细菌、莱茵藻和拟南芥的 结构进行叠加对比发现，整体结 第 期常圣海等：嗜热紫硫细菌 的冷冻电镜结构研究 图 紫硫细菌与其他物种 的对比结果。的 对比结果，蓝色为紫硫细菌，橙色为蓝细菌，浅绿色为莱茵 藻，黄色为拟南芥；图右为紫硫细菌底物结合口袋和拟南芥的对比结果，为底物类似物；大亚基 端结构域的氨基酸序列比对结果。，；构相似，有两处细小差别。紫硫细菌 端 相较于其他会形成一个更明显的突起结构（图 绿色框所示），序列比对中也明显存在一段独特的序列（图 绿色框中所示）。紫硫细菌的 ，与蓝细菌相似都比较短，不同于高等植物，这段 是区分高等植物与细菌的重要特征（图 和图 中黑色框所示）。序列比对显示 的序列高度相似，然而 的序列差异性较大。对 的序列组成分析发现，相对于其他物种，紫硫细菌的序列中极性氨基酸残基比例显著高于其他物种（表 所示）。紫硫细菌中带电氨基酸残基占比为 ，而蓝细菌中为 ，莱茵藻中为 ，拟南芥中。氨基酸组成的差别，可能是紫硫细菌 具有热稳定型的重要原因。电子显微学报 第 卷图 紫硫细菌与其他物种 小亚基的对比结果。小亚基的 对比结果，紫色为紫硫细菌，橙色为蓝细菌，浅绿色为莱茵藻，黄色为拟南芥；小亚基的氨基酸序列比对结果。，；表 紫硫细菌与其他物种 小亚基的氨基酸组成对比结果 碱性氨基酸，酸性氨基酸，讨论 作为光合作用暗反应的关键固碳酶，其天然催化效率低，高温环境下高等植物 的催化效率进一步显著降低。全球变暖的趋势下，借鉴高温环境下光合自养紫色硫细菌的 精细三维结构，设计在温室效应下具有稍高催化效率的高等植物，有着极其可观的应用价值。本研究仅仅使用 个小时 冷冻电镜机时，收集 张数据，成功解析 分辨率的 原子结构，是目前采用冷冻电镜技术解析的分辨率最高的 结构。对获取的 的 结构进行对比分析发现，它与其他非高温环境生存物种的 整体结构基本相似，局部存在一些差别。第 期常圣海等：嗜热紫硫细菌 的冷冻电镜结构研究 本研究获取的 未结合镁离子，处于 状态，在后续研究中可以改变制样条件，加入底物类似物，获取其他状态的 结构；的 端 较短，且基因组中不存在 的同源序列，该结构的具体激活机制尚不清楚；基因组中也不存在高等植物 组装伴侣（，）同源基因，推测其 的组装可能具有特殊的机制；的 端 存在一段突起结构，后续可以通过分子生物学手段验证其是否影响 的稳定性；的 序列组成中，带电氨基酸比例高，可能与其高温环境保持催化活性有关，需要进一步的生化实验证明。致谢：作者感谢日本茨城大学 教 授 提 供 本 研 究 所 用 嗜 热 型 紫 硫 细 菌 菌株细胞，感谢中国科学院植物研究所于龙江研究员在蛋白分离纯化过程中给予的帮助。参考文献：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，：，（）：，（）：，：，（）：电子显微学报 第 卷 ，（，；，；，），；