水产品中常见致病微生物快速检测体系的建立_熊志勇.pdf

2023 年第 1 期文章编号：1671-9646（2023）01a-0063-06第 1 期（总第 567 期）农产品加工No.12023 年 1 月Farm Products ProcessingJan.摘要：采用聚合酶链式反应（PCR）检测方法，针对副溶血弧菌耐热溶血毒素 tlh 基因及其毒力基因 tdh 和 trh 基因、单增李斯特菌溶血素 hly 基因、沙门氏菌 invA 基因和大肠杆菌 O157 rfbe、stx 1 和 stx 2 基因为靶基因设计引物，建立快速简便水产品中常见致病性微生物检测体系。通过确定统一的 PCR 反应条件和缩短循环时间，达到快速检测的目的。研究结果表明，建立的 PCR 体系，多靶点同步检测特异性为 100%，致病性微生物基因组 DNA 的检测限约为8.28101CFU/mL，对人工污染的水产品样品直接进行检测，检测限分别为 4103CFU/mL，2.14103CFU/mL，8104CFU/mL 和 1.07103CFU/mL，并能在 3 h 内完成检测。表明已成功建立水产品常见致病微生物的 PCR 快速检测技术。关键词：PCR；致病性微生物；快速检测中图分类号：X836文献标志码：Adoi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2023.01.017Establishment of PCR System for Rapid Detection ofCommon Aquatic-food PathogensXIONG Zhiyong，WANG Lei，*WEI Yongchun，MA Wenying（School of Materials and Environment，Beijing Institute of Technology Zhuhai，Zhuhai，Guangdong 519088，China）Abstract：In this paper，using polymerase chain reaction（PCR）detection method，with sets of primers from the tlh，tdh，trh，hly，inv A，rfbe，stx 1，stx 2 of Vibrio parahaemolyticus，Listeria monocytogenes，Salmonella and Escherichia Coliwere designed to establish a novel method for rapid detection of common aquatic-food pathogens.The results showed that the newestablished PCR system was 100%specificity and using this method was capable of detecting a minimum of 8.28101CFU/mLfor genomic DNA.This method was directly applied in the aquatic samples and the detection limit was be 4103CFU/mL，2.14103CFU/mL，8104CFU/mL and 1.07103CFU/mL respectively.It could be detected in 3 h.It reveled that a rapidPCR technique for the detection of common aquatic-food pathogens was established successfully.Key words：PCR；pathogens；rapid detection水产品中常见致病微生物快速检测体系的建立熊志勇，王磊，*魏永春，马文英（北京理工大学珠海学院 材料与环境学院，广东 珠海519088）收稿日期：2022-03-04基金项目：北京理工大学珠海学院“课程思政”改革试点课程建设项目（2020）。作者简介：熊志勇（1977），男，博士，副教授，研究方向为食品加工过程危害物控制。*通讯作者：魏永春（1971），男，硕士，讲师，研究方向为天然产物化学。0引言近年来，全球食品安全恶性事件频发，成为影响公共健康的重要因素，食品安全问题越来越成为社会关注的热点，其中，食源性致病菌是危害食品安全和人类健康的主要因素1-3。因食用水产品引起爆发性食物中毒也频繁发生，水产品中常见病原菌检测品种有副溶血弧菌、单增李斯特氏菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、沙门氏菌、大肠杆菌等。这些致病菌可引起剧烈呕吐、腹泻、头痛、发热，严重者常有脱水、全身痉挛、神志不清、血压下降等休克症状而危及生命。因此，建立针对水产品中致病微生物的有效检测体系，快速并且准确地完成对食品中致病菌的检测已成为保障食品安全和防止疾病传染的关键。这些致病微生物常规检测方法需要分离培养、生化试验和血清学试验等多个步骤，检测周期长、操作繁琐、灵敏度低，而且每次只能检测出一种致病菌。其灵敏度也受杂菌干扰的一定影响，存在一定的假阴性，且无法对人工难以培养的病原微生物进行检测，已远远不能满足现代检测要求。随着分子生物学发展，在分子生物学水平基础上建立的检测技术逐步成为食品中致病菌的检测方法。如 DNA 指纹图谱、免疫捕获、分型技术、菌落杂交、PCR、实时定量 PCR、基因芯片等，也已经显示出它在食源性致病菌检测方面的独特优势。其中农产品加工2023 年第 1 期PCR 方法该技术具有高效、高产、低成本、速度快等优点，有较好的可操作性，目前已在多种致病性微生物的检测中得到应用4-8。针对水产品常见致病性微生物副溶血性弧菌耐热溶血毒素 tlh 基因及其毒力基因 trh 和 tdh 基因、单增李斯特菌溶血素 hly 基因、沙门氏菌 invA 基因和大肠杆菌 O157 rfbe、stx 1 和 stx 2 基因为靶基因设计引物，建立能快速同时一体化检测该常见 4 种致病性微生物的 PCR 反应体系。从特异性和灵敏度方面对该方法进行评价，并将其直接应用于水产品样品中进行的实际检测。同时，也为 PCR 技术应用到其他致病菌的高效检测奠定了一定的基础，为开展病原菌的早期预警、监测、分析和调查发挥积极作用。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株58 株标准菌株，武汉工程大学提供。包括金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、小肠结膜炎耶尔森菌亚种和铜绿假单胞菌。1.1.2仪器与设备YXQ-LS-75S型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；ZHWY-2102 型双层大容量全温度恒温摇床，上海智城分析仪器制造有限公司产品；HC-2518R 型高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；DYY-6C 型电泳仪，北京六一仪器厂产品；Tocan240 型凝胶成像系统；TC-96HBPCR 型扩增仪，杭州博日科技有限公司产品；UV-7504 型单光束紫外-可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司产品；DS-1 型高速组织捣碎机，上海精科实业有限公司产品。1.1.3试剂与培养基细菌基因组 DNA 快速提取试剂盒（硅胶膜离心柱法）、Bst DNA 聚合酶、10ThermoPol Reactionbuffer、10 mmol/L dNTPs，广州东盛生物科技有限公司提供；新鲜海带，购于当地超市。副溶血性弧菌选择性培养基，青岛海博生物公司提供；大肠杆菌 O157 选择性培养基，CHROmagar公司提供；沙门氏菌选择性培养基（SS），上海科兴商贸有限公司提供。单增李斯特菌选择性培养基：蛋白胨 15.0 g，酵母膏粉 5.0 g，琼脂 15.0 g，氯化钠 5.0 g，色素 2.3 g，抑制剂 5.0 g，去离子水（平板）1 L。3%氯化钠碱性蛋白胨水：氯化钠 5 g，硝酸钾0.1 g，蛋白胨 20 g，蒸馏水 1 L，加热溶解。LB 肉汤液体培养基：LB 肉汤 21 g，蒸馏水 1 L，加热溶解。LB 肉汤固体培养基：1 L LB 肉汤液体培养基加15 g 技术琼脂粉。单增李斯特菌选择性培养基、LB 肉汤、技术琼脂粉，广东环凯微生物科技有限公司提供。1.2试验方法1.2.1菌株的培养称取 LB 肉汤 21 g 溶于 1 L 蒸馏水中，加热溶解，分装，于 121 下灭菌，得到基础培养基备用。在超净工作台内，按 5%的接种量向已灭菌的培养基中加菌种母液，于 37 下以转速 150 r/min摇床培养 12 h。1.2.2试验菌株的筛选将 58 株标准菌株分别接种到副溶血性弧菌选择性培养基、沙门氏菌选择性培养基、单增李斯特菌选择性培养基和大肠杆菌 O157 选择性培养基中，于37 下静置培养 48 h，筛选出试验所需 4 种菌株。1.2.3DNA 模板的提取（1）试剂盒法。根据细菌基因组 DNA 快速提取试剂盒说明书提取细菌基因组 DNA。（2）水煮法。取过夜培养的菌悬液 1 mL 加到1.5 mL 无菌离心管中，以转速 12 000 r/min 离心2 min，尽量吸弃上清，加入 50 L 洗脱液 TE，混匀后沸水浴 5 min，以转速 12 000 r/min 离心 5 min，取上清-20 下保存。1.2.4引物设计与合成通过查阅相关文献，检索 GenBank 数据库（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/472320310）中已公布的副溶血性弧菌 tlh 基因、单增李斯特菌溶血素hly 基因、沙门氏菌 invA 基因和大肠杆菌 O157 rfbe、stx 1 和 stx 2 基因序列，利用 PrimerExplorer V4 引物设计软件设计 LAMP 引物，将 2 条外引物 F3、B3 用于试验 PCR 体系，并将设计好的引物与 Genbank 数据库中的核酸序列进行 BLAST 比对，保证 4 种食源性致病微生物引物的高度特异性。3 种致病性微生物靶基因及其引物序列见表 1。1.2.5PCR 反应体系建立PCR 扩增体系选取 50 L，2TaqPCRMasterMix（含染料）25 L，引物 F 2 L，引物 B 2 L，模板DNA 2 L，ddH2O 19 L。由于选择扩增目的片段小，扩增所需时间短，因此设定反应程序：94，5 min；94 30 s，55 30 s，72 30 s，30 个循环；72，10 min。反应结束后，用 2%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。1.2.6PCR 反应特异性与灵敏度试验将 1.2.2 筛选出的全部试验菌株进行扩增反应，添加相应的引物。反应产物用 2%琼脂糖凝胶电泳进行分析，对该方法的特异性进行评价。同时，以水642023 年第 1 期表 13 种致病性微生物靶基因及其引物序列菌株靶基因引物（5-3）片段长度/bp副溶血性弧菌单增李斯特菌沙门氏菌大肠杆菌O157tlhtdhtrhhlyinvArfbestx 1stx 2TLF：CGCTGACAATCGCTTCTCATTLB：GTTCTTCGCTTTGGCAATGTTDF:GTTCGAGATACAACTTTTAATACCATDB:CGTGCTTATAGCCAGACACTRF:ACAACAATAAAAACTGAATCACCTRB:GACCGTTGAAAGGCCATCHLF：GGAGGMTACGTTGCTCAAHLB：AAGCTAAACCAGTGCATTCINF：GAACGTGTCGCGGAAGTCINB：CGGCAATAGCGTCACCTTRFF：AACAGTCTTGTACAAGTCCARFB：GGTGCTTTTGATATTTTTCCGS1F：TGTTGGAAGAATTTCTTTTGGAS1B：GCTAATAGCCCTGCGTATCS2F：TCGGTGTCTGTTATTAACCAS2B：TGGAAACCGTTGTCACAC214211216211