实验室斑马鱼的养殖与繁育_程旭梅.pdf

2023年 第53卷 第2期113斑马鱼概述斑 马 鱼，拉 丁 学 名D a n i o r e r i o，英文名zebrafish，动物界、脊索动物门（Chordata）、辐鳍鱼纲（Actinopterygii）、新鳍亚纲、鲤形目（Cypriniformes）、鲤科（Cyprinidae）、属（Danio）、斑马鱼（D.rerio）。原产喜马拉雅山南麓的印度、巴基斯坦、孟加拉国和尼泊尔等南亚国家的淡水水域，为杂食性热带淡水鱼，又名蓝条鱼、蓝斑马鱼、花条鱼、印度鱼、印度斑马鱼1-2。1.1斑马鱼的基本特征斑马鱼体长35cm，稍侧扁而略呈纺锤形，头小而稍尖，吻较短，背部为橄榄色，体侧从鳃盖后直伸到尾鳍有数条银蓝色纵纹，背鳍、臀鳍偏后，臀鳍部有与体色相似的纵纹，尾鳍长而呈叉形，诸鳍均呈淡黄色透明状，全收稿日期：2023-01-13基金项目：西北民族大学中央高校基本科研业务费重大需求培育项目（31920220111）。作者简介：程旭梅，在读硕士研究生，主要从事斑马鱼毒性实验的相关研究。E-mail：chengxumei7_通信作者：李志强，博士，教授，主要从事微生态相关研究。E-mail：身条纹似斑马，故得名“斑马鱼”。成体雌鱼为银灰色，体态丰满，在性成熟后腹部膨大；成体雄鱼为柠檬色，身材修长，腹部扁平。斑马鱼的臀鳍宽大，与背鳍相对应，胸鳍较小。雌鱼各鳍均比雄鱼短小，雄鱼胸鳍略呈三角形，雌鱼胸鳍略呈扇形3-4。由于条纹的多少和宽窄不同，以及鳍的差异，形成了不同品种的斑马鱼，如蓝斑马、红斑马、喷点斑马、电光斑马、豹纹斑马、虹带斑马、长鳍斑马、金丝斑马、闪电斑马等5。斑马鱼易饲养，且饲养成本低，基因与人类相似度达87%，有“水中小白鼠”之美誉。体外授精，繁殖力强，产卵量大，胚胎透明。一般3月龄性成熟，全年皆可交配产卵，一生产卵量可达数千枚，两次产卵间隔仅1周，一次可产卵200枚以上6-7。胚胎在28.5 的标准水温培实验室斑马鱼的养殖与繁育程旭梅1，周建业2，郑欣2，李志强2*（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030；2.西北民族大学口腔医学国家民委重点实验室，甘肃兰州730030）摘要：近年来，以斑马鱼为工具的各类研究发展迅速，其已成为最主要的模式动物之一，因此熟练掌握实验室斑马鱼的养殖与繁育方法，确保斑马鱼保持最佳健康状态，是利用其开展科学研究的基础条件。本文就实验室斑马鱼的养殖与繁育方法进行概述。关键词：斑马鱼；模式动物；养殖；繁育中图分类号：Q95-33文献标识码：A文章编号：1006-799X（2023）02-0113-06饲养管理DOI:10.15979/62-1064/s.2023.02.0181142023年 第53卷 第2期饲养管理养下24h发育成形，3d可孵化完成，5d可出现觅食及主动躲避行为。1.2斑马鱼的品系全球已鉴定和建立1万种以上斑马鱼品系，主要包括野生型、转基因型、突变型3种类型。将从自然界获得、并通过实验室多代稳定繁育、遗传背景清晰的斑马鱼品系称为野生型品系，主要包括ab品系、tuebingen（tu）品系、wik品系。转基因型品系和突变型品系为野生型品系经人工处理后所得。实验室常用ab品系的斑马鱼，tu品系为斑马鱼基因组计划所用，wik品系较tu品系更具形态多样性6,8-9。1.3模式动物斑马鱼的兴起模式动物是揭示生命科学规律的重要研究工具之一。鱼类从20世纪60年代末开始作为实验动物，20世纪90年代初以来，斑马鱼因其多方面优点已成为国际上在科学研究实验中使用最广泛的鱼类模式生物10。与其他经典模式动物相比，斑马鱼的应用历史并不长，但受到越来越多的重视和利用，研究领域发展迅速，前景广阔。1998年，我国第一个以斑马鱼为模式动物的发育生物学实验室在清华大学建立，从此开启了我国对斑马鱼的研究11。2002年，斑马鱼全基因组测序完成8；2003年，美国国立卫生研究院（NIH）将斑马鱼列为继小鼠和大鼠后第3大脊椎模式生物10；中国科学院水生生物研究所于2012年10月，正式成立国家重大科学研究计划斑马鱼资源中心（ChinaZebrafishResourceCenter，CZRC）11；2014年，中国实验用鱼（斑马鱼）质量控制标准启动11；2022年7月5日出版的自然遗传学杂志上发布了迄今最全面的斑马鱼基因图谱。近年来，我国斑马鱼研究飞速发展，占全球同类研究体量达20%，成为继美国之后的第二大斑马鱼研究大国12。目前，斑马鱼被广泛地用于发育生物学、分子生物学、细胞生物学、神经生物学、免疫学、海洋生物学、遗传学、肿瘤学、药物学、环境毒理学等研究领域，不断涌现新的研究成果，已成为研究脊椎动物发育、人类疾病、环境科学、水产育种等的新兴模式动物，为现代生命科学的发展作出了重要贡献13-16。实验室斑马鱼的养殖探索斑马鱼的最适养殖参数，保证斑马鱼的健康，是实验室养殖与开展一切斑马鱼相关研究工作的关键和基础，非适宜的环境会影响斑马鱼的正常生理状态，使其生长速度、成活率以及子代的数量和质量受到影响17。2.1环境实验室斑马鱼鱼房应建在安静、通风良好、电压和水能稳定供给的地方。斑马鱼对环境的要求不高，但对环境的波动较敏感。环境出现较大波动时，斑马鱼易因惊恐而出现跳缸现象，影响斑马鱼的正常生理活动。房间应无易受潮、易发霉的材料，地面应设置地漏或排水沟，有防滑处理，房门和窗户应不透光且具有良好的密闭性，保证养殖区光周期统一。2.2温度房间应具有良好的空调系统，维持养殖区域温度在28左右。28.5是养殖斑马鱼的最适温度8。养殖温度过高会降低水体的溶解氧，导致细菌在水体中滋生，而养殖温度过低会使斑马鱼生长发育缓慢，产卵量下降。适宜温度条件下，斑马鱼生长迅速，抗病能力强。斑马鱼养殖区切勿忽凉忽热，要保持恒温。2.3养殖水实验室养殖水的pH、盐度、溶氧量、硬度等要达到最适参数范围。2.3.1pH斑马鱼养殖水的pH范围为7.08.0，7.2为最佳18。鱼呼吸产生二氧化碳在水中溶解形成碳酸会降低pH值，低pH值影响卵子发育、胚晶生长，也会影响水中的溶氧状况，妨碍鱼呼吸，发生浮头，还会导致鱼进食少、生长缓慢等问题10。2.3.2盐度斑马鱼属于淡水鱼类，但能耐受较大的盐度范围。养殖系统的盐度控制在0.250.50即可10。2.3.3溶解氧溶解氧是鱼类养殖中的一项重要指标18。斑马鱼的新陈代谢速率较快，消2023年 第53卷 第2期115耗氧气的水平也就较高16。建议水体溶解氧浓度6.0mg/L，以维持斑马鱼的健康生长和活动10。目前应用较多的增氧方法是充气式增氧。空气压缩机将空气或纯氧通过散气装置，如气石，释放为小的气泡，小气泡在水中进行传质，将氧慢慢溶于水体中，成为溶解氧。溶解氧浓度过低会导致养殖系统内鱼类的大量死亡，及时清除污物、经常换水等可以增加水中溶解氧含量，但水体溶氧度过高，会使气体超过饱和浓度，产生大量气泡，导致鱼患气泡病。在斑马鱼孵化过程中，不同时期对氧气的需求不同，其孵化初期几乎不需要氧气，待鳔充气时开始需要氧气，氧气的需求量随着鱼不断长大而逐渐增加19。2.3.4紫外杀菌紫外线可以穿透细菌的细胞膜去破坏菌体的繁殖能力，从而达到杀菌目的，以确保水中无细菌滋生18。实验室常用265nm的紫外灯，每日杀菌30min，时间过长会破坏养殖水原本的生态平衡。紫外灯每半年检查更换1次。2.3.5水体硬度较高硬度的水有利于斑马鱼的生长繁殖，水体硬度可通过水中Ca2+和Mg2+等离子的含量来调节18，CaCO3含量超过100mg/L即可。2.4光照周期与光照强度斑马鱼养殖系统的适宜光周期是14h的光照周期和10h的黑暗周期10。适宜的光周期有利于斑马鱼生长繁殖20，24h连续光照或光照紊乱都会导致斑马鱼不产卵，且照明应逐渐增亮或逐渐降暗，防止斑马鱼受到突然刺激从养殖缸内跳出。斑 马 鱼 养 殖 水 体 表 面 的 光 照 强 度 在54324lux即可21。过高的光照强度会使藻类、细菌等在水体内大量滋生，影响斑马鱼的健康。光照不足，鱼房内灯光太暗，斑马鱼活力会降低，全身条纹会变暗淡。因此，斑马鱼鱼房的房门和窗户应有良好的密闭性。2.5养殖密度斑马鱼在养殖缸内的活动范围受到限制时，会使斑马鱼的生长受限，继而导致生长率下降，且过高的饲养密度会引起养殖水中代谢产物的浓度增大，不利于鱼生存10,22。常见的养殖缸规格有1L、3L、10L。建议养殖密度如下：04d胚胎期，50枚/90mm培养皿；515d幼苗期，100尾/L；1630d幼鱼期，30尾/L；3090d幼鱼期，10尾/L；90d成鱼期，58尾/L。2.6饲喂斑马鱼为杂食性热带淡水鱼类，可食用各种动物性饵料或干饲料19。市面上的人工配合饲料营养成分单一，且易恶化水质3。实验室养殖最好饲喂鲜活体饵料丰年虫。丰年虫含有丰富的蛋白质、氨基酸和脂肪，能最大限度地满足斑马鱼的营养需求，可增强斑马鱼抵抗力、提高斑马鱼成活率。2.6.1丰年虫的孵化丰年虫休眠卵可长期保存，一般低温（05）储藏在干燥避光的地方。为保证孵化率而不浪费虫卵，孵化过程应注意：一般在桶、罐、槽中孵化，最好是具有锥形底的容器；孵化前用淡水浸泡虫卵1h；孵化过程保持恒温，水温控制在2530，28最佳。低温会延长孵化时间，过高的温度会使虫卵发育停止；pH值可用NaHCO3调节，维持在7.58.5即可；孵化过程虫卵应在盐水中悬浮，避免虫卵在缸底形成死角，可在孵化缸底部放置足够的气石，连续充气，使水体翻滚。充气量要适量，既保证虫卵均匀分布，又避免虫卵机械性损伤；虫卵密度一般不超过5g/L（干重）。过高密度的虫卵孵化需增大充气量，充气过大产生的泡沫会使虫卵粘附，导致孵化率低；孵化时用日光灯或白炽灯从孵化缸上方人工光照。一般2000lux的光照即可；盐水孵化效果更好，4.5g盐需要1L水，精盐或粗盐皆可10,23。2.6.2丰年虫的收集孵化24h后，即可准备收集。静置20min，丰年虫有趋光性，关灯给予光照，会分成3层，上层为孵剩的空卵壳，最底层为尚未孵出的卵，而孵出的丰年虫位于中层。盐水孵化不宜直接喂食，用淡水将丰年虫饲养管理1162023年 第53卷 第2期饲养管理浸泡15min加以稀释，最后用滴管吸出，尽量不要有空卵壳，因为鱼体吞食带壳的丰年虫会致内脏受损。孵出的丰年虫在淡水中可存活6h，孵化出的丰年虫最好当日喂完，也可倒回孵化用盐水移至冰箱冷藏一晚，若在1617下则可存活40h。冻存的丰年虫必须先在水中解冻之后才能喂食，避免斑马鱼因争食低温饵料导致消化道疾病，且部分冷冻饵料中外渗的胞液会污染水质8。斑马鱼的繁育斑马鱼繁育可分为自然繁育和人工体外受精19，但体外受精技术如若操作不专业，会对鱼造成伤亡，因此一般选择自然繁育。为提高产卵率、受精率，获得高质量的受精卵，必须对亲鱼进行强化培育3，用于交配的雄鱼和雌鱼应健康无病、不瘦弱。挑选雌鱼时应注意区分是刚觅食的腹部膨大还是性成熟的腹部膨大。3.1胚胎的收集试验前一晚选择长期稳定培养且达到性成熟的斑马鱼，按雌雄12的比例放置于繁殖盒中，雌雄鱼用透明挡板隔开，并黑暗处理10h，避免夜间交配无法明确产卵时间。次日上午，抽掉挡板，并给予光照，在光照刺激下雌雄鱼开始交配产卵，产卵约30min后完成受精13,19。收集受精卵，用养殖水清洗23次，去除残存物，挑选正常受精、形状饱满的受精卵，转移至提前准备好的盛有适量孵化水的培养皿中稀疏培养（510枚胚胎/mL），无条件的用养殖水即可。于（281）的光照培养箱中以光暗周期1410培养待用18。3.2受精卵的孵化每天吸出死卵或胎膜，并更换养殖水1次。在受精卵孵化期间可以加入几滴1的亚甲基蓝溶液，预防鱼卵被细菌感染3,18。孵化过程应注意：更换养殖水时要用直径1cm左右的皮软管虹吸受精卵，避免对受精卵造成机械损伤；剧烈的温差会造成受精卵死亡，因此孵化用水和清洗用水的水温相差不宜过大，且要保持相对恒定，可在换水前提前备好养殖水3。受精后的第14d为胚胎期，胚胎会发育至幼苗并出膜，鱼苗从卵膜孵出，开始在卵膜外发育。孵化水温24时受精