天然产物法卡林二醇与人类G...BA_A受体相互作用的机制_沈琦.pdf

Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022050020220500(1/10)CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文天然产物法卡林二醇与人类GABAA受体相互作用的机制沈琦1，陈海瑶1，高登辉1，赵熹1，那日松2，刘佳2，黄旭日1（1.吉林大学理论化学研究所,长春 130061；2.河南农业大学植物保护学院,郑州 450046）摘要 通过分子动力学模拟、伞形采样模拟、结合自由能计算和分子对接等方法,研究了法卡林二醇在-氨基丁酸A型(GABAA)受体上结合作用的模式和对GABAA受体动态属性的影响,确定了3个有效结合位点均对此受体产生拮抗作用,为后续研究聚乙炔醇类化合物对GABAA受体作用及相应药物开发提供了理论依据.关键词 法卡林二醇；-氨基丁酸 A型受体；分子动力学模拟；拮抗作用中图分类号 O641 文献标志码 A doi：10.7503/cjcu20220500Interaction Mechanism of the Natural Product Falcarindiol and Human GABAA ReceptorSHEN Qi1，CHEN Haiyao1，GAO Denghui1，ZHAO Xi1*，NA Risong2，LIU Jia2，HUANG Xuri1（1.Institute of Theoretical Chemistry，Jilin University，Changchun 130061，China；2.College of Plant Protection，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450046，China）Abstract Falcarindiol is a natural polyacetylene alcohol compound that has demonstrated anti-inflammatory，neurological and potentially anticancer properties，and modulates the activity of the-aminobutyric acid type A（GABAA）receptor which is an important therapeutic target for neurological disorders in humans，but the mechanism of action is not clear.In this paper，the binding mode and dynamic properties of falcarindiol acting on GABAA receptor were investigated by molecular dynamics simulation，umbrella sampling simulations，binding free energy calculations and molecular docking，and determined that all three effective binding sites have antagonistic effects on this receptor.This work will provide a theoretical basis for the subsequent study of the effects of polyethynyl alcohol analogues on GABAA receptors and the corresponding drug development.Keywords Falcarindiol；-Aminobutyric acid type A（GABAA）receptor；Molecular dynamics simulation；Antagonism神经退行性疾病是大脑和脊髓的细胞神经退行性变形、丢失而导致的疾病.如帕金森、阿尔兹海默症、癫痫和亨廷顿舞蹈症等均为神经退行性疾病，主要表现为认知功能和运动功能的下降.神经退行性疾病的致病因素有很多（如氧化应激、蛋白质异常聚集、炎性机制、线粒体功能障碍和遗传等）且致病机制尚不明确，病程不可逆转.目前，全球约有4000多万人受到神经退行性疾病的影响，随着全球老龄化人口的增多，这一数字还会继续增加.所以，开发出安全有效的治疗神经退行性疾病的药物是目前亟需解决的问题.相关研究表明，多种神经退行性疾病均与神经系统内广泛表达的-氨基丁酸A型（Gamma-aminobutyricacid，GABAA）受体的功能紊乱有关，GABAA受体是许多神经类药物作用的靶收稿日期：2022-07-25.网络首发日期：2022-09-29.联系人简介：赵 熹,男,博士,副教授,主要从事生物大分子的计算及药物筛选方面的研究.E-mail:基金项目：国家自然科学基金(批准号:21702048)和河南农业大学教学改革项目(批准号:2021XJGLX100)资助.Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21702048)and the Teaching Reform Project of the Henan Agricultural University,China(No.2021XJGLX100).CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022050020220500(2/10)点15.GABAA受体是五聚体配体门控氯离子通道半脱氨酸（Cys）超家族的一员，属于神经递质受体.广泛存在于神经元突触、突触外缘或神经元膜的突触外部分，其内源性配体为GABA分子，是中枢神经系统的抑制性神经递质6，7.GABA分子与GABAA受体结合后将激活受体，使其通道开放，Cl从细胞外流向细胞内，引起神经元的超极化从而抑制神经元兴奋.因此，GABAA受体是许多治疗神经性系统疾病药物（如镇静剂、助眠剂、麻醉剂和抗惊厥药物等）的作用靶点，在平衡兴奋性信号中起着基础性的作用8，9.GABAA受体一般包含 19 个不同的亚基，共计 8 类（1-6，1-3，1-3，1，1，1，1 和 1-3）.人脑中存在较为丰富的GABAA受体亚基为，和组成的五聚体，通常以2个1，2个2和 1个2为组合形成12210.GABAA受体镶嵌于磷脂膜中，整个受体可分为胞外结构域（Extracellulardomain，ECD）和跨膜结构域（Transmembranedomain，TMD），每个亚基的胞外结构域包含一个N端螺旋、10个链和多个“Loop区”，其中Loop A，B，C在亚基上定义为“+”，Loop D，E，F定义为“”11，12.跨膜结构域由4个螺旋（M1M4）和一个可变长度的细胞质环构成.五聚体的5个M2螺旋构成受体离子通道，9位置的亮氨酸及2位置的丙氨酸和脯氨酸为通道的门控，在药物结合后会选择性地打开或关闭13，14.研究发现，聚乙炔醇化合物都可以作用于GABAA受体15.聚乙炔分布广泛且种类多，主要存在于食用植物、真菌和海藻等.聚乙炔化合物的研究从20世纪60年代中期开始受到重视，大量研究者对人参中的聚乙炔醇化合物进行了深入研究.随着对聚乙炔醇化合物的深入研究，来自不同种植物的聚乙炔醇化合物也相继被报道16，它们都可以对GABAA受体1721产生作用.Uwai等22曾研究过多种聚乙炔醇化合物与GABAA受体的作用，如菊苣毒素（Cicutoxin）、大菊毒素（Isocicutoxin）、维罗尔A，B和C（Virol A，B和C）、人参炔醇（Falcarinol）和法卡林二醇（Falcarindiol）等.综合目前已有的实验研究发现大多数聚乙炔醇化合物在结构上较为相似，以17个碳骨架为主，具有键共轭体系、烯丙基和 羟基官能团，这些结构特点对聚乙炔醇化合物的活性具有直接的影响2325.法卡林二醇分子FAD Falcarindiol（3R8S）是一种天然的聚乙炔醇化合物，存在于人参、伞形科和芹菜科的许多药用和食用植物中，法卡林二醇已被证明有抗炎、抗癌特性26，27.研究表明，法卡林二醇分子对GABAA受体具有一定的调节作用22，但其作用机制尚不明确.本文采用分子动力学模拟和相应的分析方法，研究了法卡林二醇和GABAA受体的作用位点及作用机制，为开发天然药物、研究聚乙炔醇化合物与GABAA受体的作用机制提供了理论依据.1 实验部分1.1常规动力学模拟GABAA受体的亚基有多种组合，选择了人体内含量最丰富的GABAA受体亚型122，从PDB（ProteinDataBank）库下载编号为6X40的晶体结构.结构文件由5条亚基组成，每个亚基大约含有340个残基，总残基数共17812个原子，删除不需要的结晶水分子和其它辅助结晶的杂分子.法卡林二醇分子的几何参数和三维（3D）构型通过Gaussian 09程序28在6-31+G（d）基组和B3LYP方法下进行结构优化，法卡林二醇分子是电中性的，通过能量最小化获得稳定的构象.采用FTMap服务器29来确定GABAA受体的潜在结合位点，对整个蛋白界面进行全局搜索寻找有利于特定探针结合的区域，不同探针分子（乙醇、异丙醇、异丁醇、丙酮、乙醛、二甲醚、环己烷、乙烷、乙腈、尿素、甲胺、苯酚、苯甲醛、苯、乙酰胺和N，N-二甲基甲酰胺共16种分子）的重叠域被定义为共同位点，最大的共同位点被预测为蛋白结合界面最重要的位点.这种方法相比于目前流行预测方法（GRID，CAVITY和MCSS等）可以避免许多假阳性的结合位置.通过AutoDockVina1.1.230进行位点对接，中心网格框的坐标由预测的结合位点确定.网格间距为0.1 nm，尺寸为242424的盒子，使用评分函数的随机全局优化来将配体对接到可能的结合位点进行初步识别.在每个预测位点生成了10个配体模型，根据给出的结合自由能和分子构象选出最优的对接情况.对处理好的晶体结构采用PROPKA3.1程序31进行质子化处理，在pH=7.0时确定了蛋白质氨基酸CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022050020220500(3/10)残基的状态.采用InflateGRO2程序32将其嵌入由512个POPC脂质（1-棕榈酰-2-油酰基磷脂酰胆碱）分子构成的双层膜中.脂质分子位于xy平面.蛋白质分子垂直于脂质双分子平面，能量最小化后最终移除了63个脂质分子达到平衡状态.模拟基于GROMOS54a7力场33使用SPC显性溶剂模型，由27个氯离子平衡系统电荷.体系首先经过1000步能量最小化消除原子间的不合理接触，然后进行100 ps正则系综（NVT）模拟，系统温度升至300 K.后续进行1 ns恒温恒压（NPT）模拟，保持在300 K和1105 Pa大气压，整个过程施加周期边界条件，所有键使用LINCS（LinearConstraintSolver）算法34.范德华相互作用截断半径为1.2 nm，长程静电相互作用使用PME（ParticleMeshEwald）方法35，在NPT系综下进行200 ns的分子动力学模拟.所有模拟均在GROMACS2018.8软件包36中进行，采用VMD37和PyMOL38软件包对模拟轨迹和结构进行可视化处理.法卡林二醇分子的拓扑文件由ATB服务器39得到.1.2伞形采样模拟采用伞形采样模拟来探究不同位点对氯离子进