同时携带blaNDM-1和...-2基因肺炎克雷伯菌的研究_王笑.pdf

基金项目：青大附院“临床医学”科研项目（）通讯作者文章编号：（）同时携带 和 基因肺炎克雷伯菌的研究王笑，王晓慧，姜美妍，伦立民，朱元祺，（青岛大学医学部 检验系，山东 青岛 ；青岛大学附属医院，山东 青岛 ；淄博市张店区人民医院，山东 淄博 ）摘要：目的探讨某医院儿科分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药的机制和菌株的同源性。方法 年月 年 月在某医院儿科住院患儿中分离出株对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌。细菌的鉴定和药敏采用 系统。基于 和 测序平台获得菌株的基因组和质粒序列，然后用软件分析菌株的生物学信息。酶切脉冲场凝胶电泳（）、核酸酶切脉冲场凝胶电泳（）和质粒的液相接合试验分别检测菌株的同源性和携带的质粒。结果这株肺炎克雷伯菌都携带 和 及其他的耐药基因，与呈现的多重耐药表型相符合。依据 规则，这株菌的 属于相同的克隆群，且多位点序列都属于 型。和测序结果都显示 株携带三个质粒，分别命名为（携带 ）、和（携带 ）。另外，液相接合显示 株携带的 质粒（携带 ）可水平传递到大肠埃希菌 。结论研究表明这些菌株对碳青霉烯类的耐药是因为携带了 和 基因。经检索，同时携带 和 基因的 型肺炎克雷伯菌在儿科患者中的暴发流行为国内外首次报道。关键词：肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；基因中图分类号：文献标识码：，.（，）：，（）（），（），（），：；（，：）耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌临床株的分离率逐年增加，其耐药机制主要是产碳青霉烯酶，这些酶除了水解碳青霉烯类外，还能水解大多数其他内中国实验诊断学 年月第 卷第期酰胺类抗生素，这给临床治疗药物的选择带来了严峻挑战。碳青霉烯酶主要包括肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（）和新德里金属内酰胺酶（），分别由 和 基因编码。在我国，肺炎克雷伯菌临床分离株主要产 酶，而大肠埃希菌为。这些菌往往只产一种碳青霉烯酶，即携带一个 或 基因，而同时携带两个或以上碳青霉烯酶基因的肠杆菌目细菌的报道较少，往往 也 是 个 案 报 道。因 此，本 文 对 同 时 携 带 和 基因的株肺炎克雷伯菌临床株进行研究，现报道如下。材料和方法 实验菌株株对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌（编号 ）于 年月 年 月分离自某医院儿科的住院患儿。患儿年龄为月岁。分子量标记沙门菌 、质控菌株 和 以及质粒液相接合受体菌（.）为本实验室保存。仪器和试剂细菌鉴定和药敏为 全自 动 系 统，药 敏 结 果 判 定 依 据 ；菌株携带碳青霉烯酶的初筛使用北京金山川碳青霉烯酶检测卡；脉冲场电泳系统和凝胶成像仪为 公司。酶切和 核酸酶切的脉冲场凝胶电泳实验步骤和结果判定参照相关文献报道方法。质粒的液相接合试验作为供体菌的肺炎克雷伯菌与受体菌（.）接合试验参照文献进行。菌株的高通量测序利用 和 技术平台测序，再经软件拼接获得菌株的染色体和携带的质粒全序列。然后，利用下列软件分析菌株基因组的生物学信息：依据在线 ：进行 分型；携带的耐药基因和质粒分析则分别用在线软件 （）和 （）。结果 菌株的药敏和碳青霉烯酶的初筛结果这 株 耐 碳 青 霉 烯 类 肺 炎 克 雷 伯 菌（）除了对替加环素和多黏菌素敏感外，对青霉素类、加酶抑制剂、头孢菌素类、碳青霉烯类、单环类、头霉素类、喹诺酮类和氨基糖苷类等抗菌药物都耐药（药敏结果见表）。另外，经北京金山川碳青霉烯酶检测卡试验，这株菌都显示产 和 型碳青霉烯酶。表肺炎克雷伯菌和接合子及受体菌（）的药敏结果抗菌药物抗菌药物的 （）（接合子）.氨苄西林舒巴坦 哌拉西林他唑巴坦 头孢唑啉 头孢曲松 头孢他啶 头孢吡肟 头孢替坦 氨曲南 厄他培南 亚胺培南 美罗培南 阿米卡星 妥布霉素 庆大霉素 环丙沙星 左氧氟沙星 磺胺甲恶唑甲氧苄啶 替加环素 多黏菌素 液相接合试验和 核酸酶切的脉冲场凝胶电泳结果 ，为了解菌株携带的质粒特点，将肺炎克雷伯菌 株作为供体菌，与受体菌大肠埃希菌 进行液相接合，获得接合子（命名为 ）。随后，对接合子进行验证：对接合子进行药敏试验，结果显示接合子 对氨曲南由耐药变成敏感（与供体菌的药敏比较见表）；碳青霉烯酶检测卡对接合子 的试验仅仅显示产 型碳青霉烯酶，这提示供体菌将携带 基因的质粒经 液 相 接 合 转 移 到 了 大 肠 埃 希 菌 ；对供体菌肺炎克雷伯菌 和接合子 的 核酸酶切脉冲场凝胶电泳结果显示，前者携带了三个质粒，而后者携带了一个质粒（与前者其中的一个质粒的大小相同）。核酸酶切脉冲场凝胶电泳结果详见图。肺炎克雷伯菌株和接合子的高通量测序结果为进一步探讨这些菌株和接合子 的耐药机制和携带的质粒性质，对其进行了高通量测序，获得了菌株的染色体和携带的质粒序列。经一系列在线软件分析，结果显示：这些菌株的多位点序列分型（）都是 ；测序显示肺炎克雷伯菌 株携带了三个质粒（与 核酸酶切脉冲场凝胶电泳结果相一致），分别命名为（携带 基因）、和（携带 基因）；接合子 携带的质粒大小和携带的耐药基因与 质粒完全一致，即供体菌可将携带 基因的质粒水平传递到大肠埃希菌 ，进一步验证了图 核酸酶切脉冲场凝胶电泳图（）：沙门菌 ；：肺炎克雷伯菌 ；：接合子。液相接合试验的结果。菌株的染色体和每个质粒的大小、携带的耐药基因和质粒的复制子类型详见表。此外，测序结果还表明，除了肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类的耐药是与其携带 和 基因有关外，而且这些菌株还携带不同种类的耐药基因，如喹诺酮类和氨基糖苷类等耐药基因，这与呈现的耐药表型相符合。菌株的耐药表型和染色体及质粒上耐药基因分别见表和表。表肺炎克雷伯菌 株的生物信息分析结果项目分类 长度（）耐药基因 、（）、（）、（）（）、（）、（）、（）、（）（）、（）、复制子 酶切的脉冲场凝胶电泳结果为了阐明这些菌株之间的关系，对其进行 酶切的脉冲场凝胶电泳。结果显示，除了 株与其他株菌有一条带的差异外，电泳条带的数目和位置完全一致，依据 规则，表明这株菌之间具有同源性，即来自同一克隆流行株。另外，这些菌株的 都属于 型。因此，以上结果提示 在 该 医 院 的 儿 科 患 者 中 存 在 同 时 携 带 和 基因的 型肺炎克雷伯菌的暴发流行。酶切的脉冲场凝胶电泳结果见图。讨论根据 （）报道，不同类型碳青霉烯酶的共表达在不同国中国实验诊断学 年月第 卷第期图 酶切脉冲场凝胶电泳图（）：沙门菌 ；：肺炎克雷伯菌 。家逐渐增多，尤其肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶和新德里金属内酰胺酶的共表达似乎是对公共卫生的主要威胁。等报道了于 年分离自巴西同时产 和 酶的阴沟肠杆菌，而国内油丽萍等首次报道分离于 年同时携带 和 基因的 型肺炎克雷伯菌临床株。目前，关于同时携带碳青霉烯酶 和 基因报道中的菌株数量均不多，然而，在本研究中同时携带 和 基因的 型肺炎克雷伯菌在儿科患者中检出为国内外首次报道，也是迄今为止短时间内分离菌株最多的研究。属于 类碳青霉烯酶，其活性位点上有丝氨酸残基，可被阿维巴坦（）抑制，而 酶属于类金属内酰胺酶（），其催化位点依赖于，可被乙二胺四乙酸（）抑制。值得注意的是，不能水解氨曲南（）。因此，产生 型 的细菌在体外对 表现出敏感性。然而，尽管 不能被 水解，但分离株通常还携带其他的头孢菌素酶，如 和超光谱内酰胺酶（）。本研究的测序结果经分析显示，除了携带不同的内酰胺类抗生素耐药基因外，这株菌还携带多种耐药基因，如喹诺酮类和氨基糖苷类等耐药基因，并与其呈现的泛耐药表型相符合。目前，肠杆菌目细菌同时产多个碳青霉烯酶的报道主要是同时携带了 和 基因的菌株。这两个基因既可分别位于不同的质粒，也可位于同一质粒上，或者一个位于染色体上，而另一个位于质粒上。本研究的测序与 核酸酶切脉冲场凝胶电泳都表明肺炎克雷伯菌 株携带了三个质粒，二者结果相一致。这三个质粒被分别命名为（，为 型质粒，和其他耐药基因位于该质粒上）、（，为 杂合型质粒）和（，也是 杂合型质粒，携带了 基因和多个耐药基因）。另外，液相接合试验显示，供体菌肺炎克雷伯菌 株可将携带 基因的 质粒水平传递到受体菌大肠埃希菌 ，但携带 基因的 质粒没有接合成功，这提示 菌株同时产 和 酶的机制可能是由于携带了 基因的肺炎克雷伯菌获得外源性携带 基因的 质粒，这与王辉等人研究的结果相一致。对于肠杆菌目细菌产碳青霉烯酶的检测，多数医院按照 推荐的 实验方法。但是，该方法对产两种碳青霉烯酶的细菌会有假阴性。如刘艳飞等报道厦门希瓦氏菌 株的 和 试验都呈现阳性，按照判读标准，表明该株菌产金属内酰胺酶。然而，免疫金标法显示该菌产 和 碳青霉烯酶。经进一步测序发现，该菌株携带 和 碳青霉烯酶耐药基因。因此，对于检测临床分离株是否携带两种或两种以上碳青霉烯酶，不同的检测方法具有不同的优缺点。综上所述，同时产不同类型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，除了呈现泛耐药表型外，在不同的产酶表型检测方法上呈现不同的结果，这需要不同的方法结合以避免漏检。另外，经检索，在儿科患者中，同时携带 和 基因的 型肺炎克雷伯菌的暴发为国内外首次报道。参考文献：，：油丽萍，陈爱文，秦萍，等 首例同时携带 、和 基因的 肺炎克雷伯菌临床株中国实验诊断学，（）：，：冯渐焘，陈爱文，李笃军，等携带 基因肺炎克雷伯菌新生儿分离株的研究中国实验诊断学，（）：，：，（）：，：，：，：，：刘艳飞，刘真真，吕金峰，等 厦门希瓦氏菌临床株对碳青霉烯类耐药的分子机制中国实验诊断学，（）：，；（）：（收稿日期：）通讯作者文章编号：（）子宫体中肾管癌例顾宇，马景超，王雪梅，张磊超，王学菊（吉林大学中日联谊医院 病理科，吉林 长春 ）临床资料 一般资料患者，岁，女性，余天前无明显诱因出现不规则阴道流血，量时多时少，量多时为平素月经量的倍，伴大量凝血块，伴头晕、乏力，量少时呈点滴状，淋漓不尽，色暗红。就诊于当地医院，行诊断性刮宫术，术后病理结果：子宫内膜不典型增生，建议进一步手术治疗。患者经门诊检查以“阴道流血原因待查”收入吉林大学中日联谊医院。妇科超声：子宫前位，子宫体大小约 ，轮廓清晰，各壁反射不均匀。于子宫左前壁探及大小约 的低回声。宫腔内探及内膜样反射，单层厚 ，回声不均匀，其内可探及大小约 的低回声，边界欠清。病理检查大体检查：宫体近右侧宫角内膜见一隆起型肿物，大小 ，切面灰白质实，与周围界限不清，似侵及浅肌层，其余内膜灰红，厚 ，肌壁间见灰白结节枚，大小 ，切面灰白质韧编织状。显微镜检查：肿瘤组织在宫腔内呈外生性及浸润性生长，浸润肌壁厚约 ，肿瘤由多种组织学形态构成，主要以小管状为主，伴腺管导管状，乳头状或鞋钉样结构，筛状，肾小球样，核分裂象易见，腺腔内见有嗜酸性分泌物，小管内上皮为单层扁平及立方上皮，局部细胞核呈空泡状，可见核重叠及核沟，类似于甲状腺乳头状癌，肿瘤周边可见 、部分阳性，、局灶阳性，野生型表达，约 阳 性，错 配 修 复 蛋 白 、表达均为阳性。病理诊断：子宫内膜中肾管癌。讨论中肾管癌是女性生殖细胞肿瘤的罕见类型，最常发生于子宫颈，在之前被认为是来自正常或增生性中肾管残件，成人仅有无功能的中肾管残留，卵巢、子 宫 颈侧 壁 或是 阔 韧带，阴 道及子宫体很少见。第版 女性生殖器官肿瘤分类内膜癌增加了种“其他类型”：中肾管癌、中肾样腺癌、非特异鳞癌以及胃肠型黏液癌。中肾管癌罕见，大约占子宫内膜癌的，侵袭性更强。大部分表现为多种组织学类型，包括腺管状、小管状、筛状、实性和性索样及骨肉瘤样，这些类型可以部分或同时混合存在于同一肿瘤内，其中最常见的类型为小管状及腺管状。小管状结构大部分由小而圆的小管组成，衬覆立方或扁平上皮。所有患者几乎都存在腺腔内嗜酸性分泌物。小管常为弥漫浸润性或背靠背生长，腺管状结构则由大的腺体或类似子宫内膜腺癌的乳头状结构组成。腺体大中国实验诊断学 年月第 卷第期