四明山野生杜鹃花资源遗传多样性和亲缘关系分析_李东宾.pdf

V Jan N14812023o o 2 0 2 3 年1 月第48卷第1期林业科技FORESTRY SCIENCE&TECHNOLOGY四明山野生杜鹃花资源遗传多样性和亲缘关系分析李东宾1徐婧1何立平1许志斌1沈登锋2*（1.浙江省宁波市林场，浙江 宁波 315440；2.宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040）摘要：利用 EST-SSR 毛细管电泳荧光标记技术，对浙东四明山有野生分布的 6 种杜鹃花资源进行遗传多样性和亲缘关系分析，为区域内野生杜鹃花的资源保护、种群恢复、种质创新提供科学依据。遗传多样性指数结果表明，6 种野生杜鹃花遗传多样性差异明显，云锦杜鹃、马银花、羊踯躅遗传多样性高，映山红、满山红次之，珍稀濒危植物华顶杜鹃遗传多样性最低。6 种杜鹃花遗传距离为 0.203 2.173，亲缘关系为 0.114 0.816，满山红和马银花的遗传距离最大、亲缘关系最远，和华顶杜鹃遗传距离最小、亲缘关系最近。遗传分化系数和基因流数据显示 6 种杜鹃种群间遗传分化很大、基因交流受阻。在聚类分析和主成分分析中，6 种杜鹃花聚为 4 类，华顶杜鹃和映山红、满山红聚为 1 类，佐证了华顶杜鹃属于映山红亚属轮生叶杜鹃组的结论。关键词：杜鹃花；EST-SSR；遗传多样性；亲缘关系；四明山中国分类号：S759.95；S512.1 10.2 文献标识码：A 文章编号：1001-9499（2023）01-0015-05杜鹃花属（Rhododendron）是北半球最大的木本植物属，属内植物大多株形古朴优雅、花色丰富艳丽，具有极高的观赏价值，是我国十大传统名花，在世界园艺界也占有重要地位1。中国是野生杜鹃花属植物资源最丰富的国家，有 720 种，其中特有种 450 种2。浙江省杜鹃花资源有17 种 2 变种及 1 变型（不包括栽培种）3，浙东四明山区域有自然分布的为映山红（R.simsii）、满山红（R.mariesii）、华顶杜鹃（R.huadingense）、羊踯躅（R.molle）、马银花（R.ovatum）、云锦杜鹃（R.fortunei）6 种，隶属于 4 个亚属4。遗传多样性是生物多样性的本质，是物种适应环境的核心基础和进化的内在动力，也是保护生物学研究重点工作，可为物种保护及利用提供适宜的策略5。随着分子标记技术体系日益成熟，利用分子标记技术探究评估种质资源的遗传多样性和亲缘关系已成为一种常用方法6。EST-SSR分子标记随转录组测序技术的成熟开发经济、快速、简单，具有信息量大、共显性、通用性高等特点7，已被广泛运用于龟峰山杜鹃花8、西双版纳苦茶9、邵武碎铜茶10、贵州刺梨11、额济纳湿地多枝柽柳12等种质资源的遗传多样性研究和亲缘关系分析，并取得了良好的实验结果。四 明 山 区 域 地 处 浙 东 宁 波 市 西南 部，位 于121 0311 2 1 2 5 3 3 E，29 32 1329 59 56 N，光照充足，雨量充沛，属于典型的北亚热带气候13。区域内地形复杂，山势险峻，沟谷纵横，植物资源丰富，是宁波最重要的生态保护区和水源涵养地。四明山区域分布着国内最大规模的华顶杜鹃野生种群，华顶杜鹃为浙江省特有种，观赏价值高，自然分布区域狭窄，种群数量稀少，并且在系统发育研究中具有重要价值14，已被列为浙江省珍稀濒危植物、国家二级重点保护野生植物。华顶杜鹃 1990 年才被发现于天台华顶山，因独特的形态特征其分类归属尚存争议，颜士辉15、李美芹16等做了华顶杜鹃的分子标记开发及亲缘关系分析，均未能明确解决它的分类归属问题。本文利用 EST-SSR 标记进行四明山区域内野生杜鹃花资源的遗传多样性和亲缘关系研究，从分子角度分析区域内杜鹃花资源的种群遗传多样性和亲缘关系以及华顶杜鹃的分类归属问题，旨在为该区域内野生杜鹃花的资源保护、种群恢复、种质创新提供科学依据。1 材料与方法1.1 材料本研究对象为在四明山区域有自然分布的映山红、满山红、华顶杜鹃、云锦杜鹃、马银花和羊踯躅 6 种野生杜鹃花资源。测试样品于 2021 年*宁波市 2025 现代种业重大专项（2021Z005）；宁波市林场科技项目(LK202102)第 1作者：李东宾（1987-），男，林业工程师，研究方向为林木遗传育种。通讯作者：沈登锋（1986-），男，工程师，从事林木遗传育种研究。收稿日期：2022-11-20DOI:10.19750/ki.1001-9499.2023.01.004第 48卷林业科技169 月在四明山国家森林公园内海拔 600800m 野生杜鹃花分布比较集中的区块内寻找目标野生杜鹃花资源并取样，每个种采样 15 个单株，单株距离要大于 30m，每株采集 35 片健康幼嫩叶片，迅速置于盛有变色硅胶的密封袋干燥保存。采集完成后带回实验室用液氮处理后存于-70超低温冰箱，用于 DNA 提取。1.2 DNA 提取与质量检测采用改良 CTAB 法17提取试验样品总 DNA，用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行杜鹃花 DNA 分子量检测，用紫外分光光度计（nano drop 2000）检测提取的 DNA 的质量和浓度，最终统一将不同样品的 DNA 浓度稀释至 50ng/L 于-20放置备用。1.3 EST-SSR 引物的筛选参照红马银花的 12 对多态性好且稳定的EST-SSR 引物序列18进行本试验引物的筛选，每种杜鹃花随机选择 3 个基因组 DNA 作为模板对 12 对引物进行筛选，选取条带扩增清楚，多态性高的引物用来进行试验材料的群体遗传多样性分析。引物由上海生物工程公司合成，筛选出的引物在正引物的 5 末端进行荧光标记。PCR 体系 20L：10L 2Taq plus PCR MasterMix，1L 50g/mL 模板 DNA、0.3L 10uM 的正向引物和反向引物、和去离子水补足至 20L。PCR 扩增程序如下：94预变性 3min；94变性30s，5358退火 30s，72延伸 45s，运行 32个循环；72最终延伸 7min，最后 4保存终止反应。利用毛细管电泳对 PCR 产物进行分析，使用 genemarker 2.0 进行结果的确认和读取。1.4 数据分析处理使用 GenAlex 6.41 估算 6 个种群的遗传参数，包括位点比较等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、shannon 多样性指数（I）、群体内固定系数（F）等来衡量 6 个杜鹃种群内遗传多样性的水平。并计算种群间遗传分化系数（Fst）、基因流（Nm）、Neis 标准遗传距离、亲缘关系及主成分分析(PCoA)和分子方差分析（AMOVA）等，并根据 Nei s标准遗传距离，利用 NTSYSpc 2.10e软件非加权配对算术平均法(UPGMA)对各居群进行聚类来分析种群间的亲缘关系。2 结果与分析2.1 引物筛选使用 6 个不同种的杜鹃花基因组 DNA 进行了12 对 EST-SSR 引物组合筛选，共筛选出 6 对电泳条带清楚，多态性高的引物组合用于试验样品的遗传分析。表 1 筛选出的 6 对 EST-SSR 引物的序列信息引物组合正向引物序列反向引物序列退火温度（）期望片段（bp）SSR1 CGCTTTTCTCAACTGTGCTTT GCGTTGATGATTTGGCTCTA50155SSR2 CGTCACATCAGCCGAGAGTAACAAGGCCCACGTTGGAG54160SSR3 CACGATCAACTCGTCCTCCTACCTCCTTCCCCAAAACACT54140SSR4 TTCTCACGCCCATTTTCTCT TGGCACTTCAGTTGCAAGTAT50165SSR5 TACTCGGGTTATGCACCCATGGTGTGCAAGGACACCTTTT52210SSR6 TACTTTGGGGACCATCCGTAGGTGCCCCCAGTATAGTGAA522302.2 6 种杜鹃花资源的遗传多样性分析根据 GenAlex 分析结果（表 2）可知，四明山 6 种野生杜鹃花的遗传多样性参数差异明显。等位基因数（Na）和有效等位基因数（Ne）为1.755.50、1.332.87，均表现为马银花最大，华顶杜鹃最小。马银花和华顶杜鹃的观测杂合度（Ho）期望杂合度（He），其余 4 种则Ho 羊踯躅 映山红 云锦杜鹃 满山红 华顶杜鹃。比较F固定指数可知，映山红 0.621最高，满山红和云锦杜鹃接近于 0，而华顶杜鹃最低为-0.385。表 2 6 个杜鹃花属种群遗传多样性指数杜鹃种群NNaNeHoHeIF马银花15 5.500.645 2.8740.810 0.6510.1090.5830.0841.2160.211-0.1170.099映山红15 3.250.629 2.3220.553 0.1910.0900.5010.1020.8890.2170.6210.159满山红15 2.500.645 1.6160.336 0.2600.1410.2910.1460.5230.2550.0700.122羊踯躅15 4.000.707 2.5220.451 0.4330.1750.5580.0851.0480.1870.3020.221华顶杜鹃15 1.750.250 1.3270.229 0.3210.2300.1900.1100.2980.148-0.3850.267云锦杜鹃15 3.001.291 2.0200.742 0.4450.1940.4560.1590.8220.318-0.040.352注：N样本数；Na不同等位基因数；Ne有效等位基因数；I.Shannons 信息指数；Ho观测杂合度；He期望杂合度；F固定指数第 48卷17表 3 6 个杜鹃花属种群成对分化系数及基因流分析表 5 6 个杜鹃属种群遗传距离和亲缘关系表 4 6 个杜鹃花属种群分子方差（AMOVA）分析种群 1/种群 2FstNm马银花/映山红0.2690.680马银花/满山红0.3850.400马银花/羊踯躅0.1251.743马银花/华顶杜鹃0.4200.345马银花/云锦杜鹃0.3050.570映山红/满山红0.1471.455映山红/羊踯躅0.2050.969映山红/华顶杜鹃0.1971.016映山红/云锦杜鹃0.2430.777满山红/羊踯躅0.3740.418满山红/华顶杜鹃0.1701.219满山红/云锦杜鹃0.3520.461羊踯躅/华顶杜鹃0.3430.478羊踯躅/云锦杜鹃0.2510.744华顶杜鹃/云锦杜鹃0.3270.515变异来源自由度方差综合 平均方差 变异组分变异百分率种群间596.65319.3311.35631%种群内84201.5833.0543.05469%总计89298.2364.411100%2.3 6 种杜鹃花资源的亲缘关系分析由 表 5 可 知，6 种 杜 鹃 花 亲 缘 关 系 为0.1140.816，遗传距离为 0.2032.173。其中马银花和满山红遗传距离最大为 2.220，亲缘关系最远为 0.109；满山红与华顶杜鹃遗传距离最小为 0.252，亲缘关系最近为 0.778。利用 Neis 遗传距离，采用平均聚类法对 6 种杜鹃花自然种群进行聚类分析（图 1），6 种野生杜鹃花资源明显聚为 2 组 4 类，映山红、满山红和华顶杜鹃聚为 1 类，其他 3 种单独为 1 类。利用 GenAlEx 分析种群间主成分分析(图 2)，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的贡献率分别为 66.26%和20.64%，累计贡献率 86.90%。图中 2 个种的距离越近，说明其遗传背景差异越小，亲缘关系越近。种群马银花映山红满山红羊踯躅华顶杜鹃云锦杜鹃马银花1.0001.7362.2200.5451.9131.184映山红0.1761.0000.2800.7620.3720.436满山红0.1090.7561.0001.5770.2520.622羊踯躅0.5800.4670.2071.0000.