梭鲈ho1基因的克隆及其低氧胁迫下表达分析_吉宇丹.pdf

DOI:10.12131/20220187文章编号：2095 0780（2023）02 0098 09梭鲈 ho1 基因的克隆及其低氧胁迫下表达分析吉宇丹1,2，孙志鹏1，吕伟华1，鲁翠云1,2，曹顶臣1，刘天奇1，周 佳1,2，郑先虎1,21.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所/农业农村部淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 1500702.上海海洋大学/农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306摘要：梭鲈(Sander lucioperca)对低氧极敏感，在集约化养殖和苗种运输过程中易发生低氧应激和死亡现象。为探究血红素加氧酶1(Heme oxygenase 1,HO1)在梭鲈响应低氧过程中的调节作用，通过RACE(Rapid amplification of cDNAends)技术克隆了梭鲈ho1基因，其cDNA全长为1 256 bp，包含840 bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF)、162 bp的5非编码区(Untranslated region,5-UTR)和254 bp的3-UTR，编码279个氨基酸。多重序列比对显示，梭鲈HO1与翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)、舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)和大口黑鲈(Micropterus salmoides)的氨基酸序列相似性分别为91.84%、88.69%和88.11%。实时荧光定量结果显示，ho1基因在所有检测组织中均有表达，其中在脑组织中高表达，其次是肾、肝、鳃等组织。低氧刺激前3 h，梭鲈ho1主要在皮肤、鳃中响应；低氧胁迫3 h后，ho1主要在心、肝、肾中发挥转录调控作用。复氧12 h，除肝脏外，梭鲈其他组织ho1的相对表达量均可恢复正常，低氧刺激对肝组织ho1的表达产生了较大影响。研究表明，ho1基因参与梭鲈响应低氧的分子调节机制并在其中发挥着重要的生物学功能，可为深入了解梭鲈低氧胁迫遗传机制提供理论参考。关键词：梭鲈；ho1；基因克隆；低氧胁迫；基因表达中图分类号：S 965.1文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Characterization and expression analysis of ho1 from Sander luciopercaunder acute hypoxia stressJI Yudan1,2,SUN Zhipeng1,LYU Weihua1,LU Cuiyun1,2,CAO Dingchen1,LIU Tianqi1,ZHOU Jia1,2,ZHENG Xianhu1,21.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences/Key laboratory of Freshwater Aquatic Biotech-nology and Breeding,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Harbin 150070,China2.Shanghai Ocean University/Key Laboratory of Freshwater Aquatic Germplasm Resources,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Shanghai 201306,ChinaAbstract:Sander lucioperca is extremely sensitive to hypoxia,and is prone to hypoxia stress and death during intensive breed-ing and seedling transportation.In order to investigate the regulating effect of heme oxygenase 1(HO1)in the response to hypo-xia of S.lucioperca,we cloned the full-length cDNA sequence of ho1 gene by RACE(Rapid amplification of cDNA ends)techno-logy.The results indicate that the cDNA length was 1 256 bp(840 bp ORF,162 bp 5-UTR and 254 bp 3-UTR),encoding 279amino acids.The multiple sequence alignment shows that the similarity of HO1 with Siniperca chuatsi,Dicentrarchus labrax andMicropterus salmoides was 91.84%,88.69%and 88.11%,respectively.Real-time quantitative PCR discloses that ho1 was ex-pressed in all the tested tissues,with the highest concentration in the brain,followed by the kidney,liver and gills.During the第 19 卷第 2 期南 方 水 产 科 学Vol.19，No.22023 年 4 月South China Fisheries ScienceApr.，2023收稿日期：2022-07-05；修回日期：2022-08-16基金项目：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助(HSY202009Q)；国家重点研发计划项目(2019YFD0900405)；中央引导地方科技发展专项(ZY21C03)；国家淡水水产种质资源库项目(FGRC18537)作者简介：吉宇丹(1997)，女，硕士研究生，研究方向为水产生物技术与遗传育种。E-mail:通信作者：郑先虎(1982)，男，研究员，博士，研究方向为水产生物技术与遗传育种。E-mail:first 3-hour hypoxic stimulation of Pikeperch,ho1 primarily responded in the skin and gills,but mainly played transcriptionalregulatory roles in the heart,liver and kidney after 3 h of hypoxic stress.At 12th hour of reoxygenation,the expression levels ofho1 in all the tissues except the liver returned to a normal level,and hypoxia stress had an enormous effect on the expression ofho1 in the liver.The study reveals that ho1 gene is involved in the molecular regulation mechanisms of S.lucioperca in responseto hypoxia and plays an important biological role,which provides theoretical references for understanding the genetic mechani-sm of hypoxic stress.Keywords:Sander lucioperca;ho1;Gene clone;Hypoxia stress;Gene expression低氧环境影响鱼类的生存、生长、繁殖和代谢等生命活动1-3。为适应低氧环境，鱼类在长期进化中形成了一系列的低氧适应机制，由低氧诱导因子(Hypoxia inducible factor,HIF)介导的低氧信号传导途径在环境缺氧应答机制中起主导作用4。血红素加氧酶 1(Heme oxygenase 1,HO1)是血红素降解过程中的起始酶和限速酶，可将血红素降解形成胆绿素、一氧化碳(CO)和游离铁，这三种代谢产物均是机体重要的生物效应分子，可以保护细胞免受氧化应激损伤5；ho1 是 HIF 信号通路的靶基因之一，具有重要生物学功能。目前，ho1 序列及其表达特征已在多种鱼类中报道，如斑马鱼(Daniorerio)6、舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)7、卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)8、团头鲂(Megalobramaamblycephala)9、南亚野鲮(Labeo rohita)10等。研究表明，鱼类 ho1 在低氧刺激下能够为细胞提供保护作用。如鲫(Carassius auratus)ho1 对于抗低氧诱导的细胞凋亡具有重要作用，可保护细胞应对低氧刺激11；ho1 可调节金鱼(C.auratus)对低氧的呼吸反应12；斑马鱼 ho1 可通过抗细胞凋亡发挥低氧保护作用13。梭鲈(Sander lucioperca)隶属鲈形目、鲈科、梭鲈属，具有生长速度快、抗病能力强、肉质细嫩、营养价值高14等特点，在欧洲具有较高的市场认可度15。20 世纪 90 年代我国梭鲈人工繁育取得成功，目前在东北、西北、华北、华东、华南等地区均有养殖，已成为我国重要的淡水名优养殖鱼类。梭鲈为凶猛性鱼类，性情急躁，应激反应强烈，对低氧极为敏感。研究显示，梭鲈养殖的最佳溶解氧(DO)质量浓度为 79 mgL116，因此在集约化养殖和苗种运输过程中容易发生低氧应激、死亡等现象。目前，关于梭鲈对低氧的耐受性及其适应机制研究报道较少，Baekelandt 等17研究发现，养殖水域的 DO 质量浓度为 46 mgL1时，梭鲈的采食量和生长速度均降低；Nadine 等3报道，在DO 质量浓度为 3.2 mgL1的缺氧环境中，梭鲈头肾中淋巴细胞数量下降，头肾和肝脏中的免疫和应激基因(包括 fth1、hif1a 和 nr3c1)表达量下调。可见低氧显著影响到梭鲈的生长、免疫调节等重要生命活动，但有关梭鲈低氧应激分子机制的研究尚不多见，血红素加氧酶 1 在低氧胁迫下的响应机制尚不清楚。本研究通过对梭鲈低氧相关基因 ho1 的克隆及序列特征分析，探讨了梭鲈 ho1 在各组织中的表达模式，并检测了低氧、复氧下皮肤、鳃、心、肾、肝、脑中 ho1 的表达规律，以期为梭鲈养殖、运输等技术研发提供数据支持，同时也为梭鲈耐低氧机制研究、耐低氧育种提供理论参考。1 材料与方法 1.1 实验动物实验用梭鲈来自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所呼兰试验场。选取体格健壮、体表无伤、规格基本一致的 1 龄梭鲈 220 尾，体质量(736)g，体长(20010)mm，于实验室循环水系统水族箱中暂养 7 d，正常投喂配合饲料。暂养期间，保持 DO 质量浓度大于 8 mgL1，水温(180.2)。实验前禁食 24 h。1.2 低氧胁迫与恢复试验取 30 尾实验鱼，放入密闭水族箱中，用于测试“浮头点”。低氧胁迫前，采用 YSI 多功能水质分析仪测得 DO 质量浓度为 9.9 mgL1，水温 18。停止增氧，观察鱼的活动情况，当实验鱼开始因低氧而浮在水面吞食空气时，则达到“浮头点”，此时水中 DO 质量浓度为 3.5 mgL1。因此，本实验将低氧胁迫 DO 质量浓度设定为 3.5 mgL1。取 90 尾实验鱼平均放至于 3 个循环水族箱中作为常氧对照组(DO 质量浓度 10 mgL1)，90 尾实验鱼平均放至于 3