四环素类抗生素降解菌的筛选及降解特性探究_曹欢.pdf

第12期曹欢，黄泽昊，苏彩萍，等.四环素类抗生素降解菌的筛选及降解特性探究J.环境科学与技术，2022，45（12）：19-28.Cao Huan，Huang Zehao，SuCaiping，et al.Screening and degradation characteristics of tetracyclines degrading bacteriaJ.Environmental Science&Technology，2022，45（12）：19-28.环境科学与技术 编辑部：（网址）http:/（电话）027-87643502（电子信箱）收稿日期：2022-07-01；修回2022-09-08作者简介：曹欢（1997-），女，硕士研究生，研究方向为微生物学，（电子信箱）；*通讯作者，（电子信箱）。Environmental Science&Technology第45卷 第12期2022年12月Vol.45 No.12Dec.2022四环素类抗生素降解菌的筛选及降解特性探究曹欢1，黄泽昊2，苏彩萍2，任宇红1*（1.华东理工大学生物工程学院，生物反应器工程国家重点实验室，上海200237；2.上海舒圣投资管理有限公司，上海201399）摘要：利用微生物降解环境中的抗生素是一种绿色有效的方式。为了减轻环境中大量残留的四环素类抗生素（TCs）污染，文章从生物肥料样品中分离得到2株具有同时降解四环素（TC）和土霉素（OTC）能力的Lysinibacillus sp.菌株，分别命名为TO1和TO2；以及2株具有降解强力霉素（DC）能力的菌株，分别命名为D1（Providencia sp.）和D2（Proteus sp.）。在以TCs为唯一碳源的条件下，探究接种量、初始抗生素浓度、温度及pH对TCs降解率的影响，结果表明：TO1、TO2对OTC的生物降解率在第4天最高可达到30.15%和32.59%，总降解率分别为91.50%和92.94%。在第7天，TO1、TO2对TC的生物降解率最高可达到61.81%和59.20%，总降解率分别为88.66%和 91.61%；且D1、D2对DC的生物降解率最高可达到48.21%和52.73%，总降解率分别为56.15%和60.22%。选取Bacillus subtilis 和Escherichia coli作为毒性指示菌以评估TCs生物降解反应中的产物毒性，结果显示：生物降解产物的毒性显著低于水解产物，证明微生物降解抗生素对环境安全友好，具有实际应用前景。关键词：四环素；土霉素；强力霉素；生物降解；降解特性中图分类号：X172；X53文献标志码：Adoi：10.19672/ki.1003-6504.1560.22.338文章编号：1003-6504(2022)12-0019-10Screening and Degradation Characteristics of Tetracyclines Degrading BacteriaCAO Huan1，HUANG Zehao2，SU Caiping2，REN Yuhong1*（1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,School of Biological Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China;2.Shanghai Shusheng Investment Management Co.,Ltd.,Shanghai 201399,China）Abstract：Using microorganisms to degrade antibiotics in the environment is a green and effective way.In order to mitigatethe contamination of large amounts of residual tetracycline antibiotics(TCs)in the environment,two strains of Lysinibacillussp.with the ability to degrade both tetracycline(TC)and oxytetracycline(OTC),named TO1 and TO2,respectively,and twostrains with the ability to degrade doxycycline(DC),named D1(Providencia sp.)and D2(Proteus sp.),respectively,wereisolated from biofertilizer samples.The effects of inoculum,initial antibiotic concentration,temperature and pH on the degradation rate of TCs were investigated under the condition of using TCs as the only carbon source,the results were obtained:the biodegradation rates of TO1 and TO2 for OTC could reach up to 30.15%and 32.59%on the fourth day,and the total degradation rates were 91.50%and 92.94%,respectively.On the seventh day,the highest biodegradation rates of TO1 and TO2 toTC could reach 61.81%and 59.20%,and the total degradation rates were 88.66%and 91.61%,respectively;and the highest biodegradation rates of D1 and D2 to DC could reach 48.21%and 52.73%,and the total degradation rates were 56.15%and60.22%,respectively.Bacillus subtilis and Escherichia coli were selected as toxicity indicator bacteria to assess the toxicity ofproducts in the biodegradation reaction of TCs.The results showed that the toxicity of biodegradation products was significantly lower than that of hydrolysis products,which proved that microbial degradation of antibiotics is environmentally safe andfriendly,and has practical application prospects.Key words：tetracycline;oxytetracycline;doxycycline;biodegradable;degradation characteristics四环素类抗生素（tetracycline antibiotics，TCs）通过与细菌核糖体30S亚单位上的tRNA结合位点相结合，从而抑制细菌蛋白质的合成，可用于预防或治疗病原微生物引起的感染1，2。因其具有成本低、副作用小第45卷和抗菌范围广等特点，被广泛应用于人类医药行业、畜禽养殖业及农业等3，4。由于TCs的使用量过大，且通常不能被人类或动物完全吸收或代谢，因而其在各种环境基质（如水体、土壤）中残留较高5。环境中残留的TCs不仅会影响微生物群落的组成结构及功能活性，还会通过食物链的生物累积导致人体肠道微生物菌群的破坏6。因此，寻找绿色有效的方式来解决环境中TCs污染的问题具有重要意义。目前，常用的去除TCs 的物理化学方法包括水解7、吸附8、光解9、电化学10及高级氧化11等。虽然上述方法在一定程度上可以去除TCs，但其存在效率较低、工艺复杂、成本及能耗较高以及易造成二次污染等问题12，13。相较物理化学法，生物降解法具有高效、成本低廉、操作简单以及安全环保等优势，是一种极具前景的去除抗生素的方式14。研究人员已从活性污泥、废水、污染的土壤或海水中分离得到一些TCs降解菌，如克雷伯氏菌Klebsiella sp.SQY515、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia DT116及烟草节杆菌Arthrobacter nicotianae OTC-1617等。值得注意的是，大部分菌株均需提供额外的营养物质才能发挥高效的降解作用。因此，仍需筛选适应性更强、效率更高的TCs降解菌。TCs中的四环素（tetracycline，TC）、土霉素（oxytetracycline，OTC）及强力霉素（doxycycline，DC）等使用范围最广，因此文章选取TC、OTC及DC作为研究对象，对上海舒圣投资管理有限公司提供的生物肥料样品进行驯化分离，并在以TCs为唯一碳源的条件下筛选得到具有降解TCs能力的菌株。同时，通过探究不同条件（温度、pH、接种量及初始抗生素浓度）对TCs降解率的影响，得到TCs降解菌的最适降解条件。本研究为生物治理TCs污染提供了新的候选微生物，并为环境生物修复技术提供实验依据。1材料与方法1.1材料与试剂生物肥料样品来自上海舒圣投资管理有限公司；四环素（TC）、土霉素（OTC）及强力霉素（DC）标准品均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，均购自上海玻尔化学试剂有限公司；蛋白胨、酵母粉、氯化钠及草酸为分析纯，均购自上海泰坦科技股份有限公司。1.2TCs的检测分析方法使用高效液相色谱仪（HPLC）对TCs进行定性定量检测，色谱柱：Aglient SB-aq C18（250 mm4.6 mm，5 m）；检测器：紫外检测器；流动相：0.1 mol/L草酸/甲醇/乙腈=76/16/8（用于TC/OTC检测）、0.1 mol/L草酸/甲醇/乙腈=7/2/1（用于DC检测）；流速：1 mL/min；柱温：30；波长：355 nm（用于TC/OTC检测）、350 nm（用于DC检测）；进样量：10 L。1.3菌株的富集驯化及分离称取 0.05 g 生物肥料样品分别加入含 20 mg/LTC/OTC/DC的50 mL LB液体培养基17中，在37、200 r/min的条件下培养24 h，以获得种子液。随后按1%的接种量吸取500 L种子液分别接种至含40 mg/LTC/OTC/DC的50mLLB液体培养基中，继续培养24h。重复以上操作，并通过梯度增加TC/OTC/DC的浓度（60、80、100 mg/L）对菌株进行富集驯化，以获得TCs耐药菌。接下来，对TCs耐药菌进行分离纯化。将富集驯化后的培养液用无菌水稀释106倍，吸取100 L稀释后的培养液均匀涂布于含60 mg/LTC/OTC/DC的LB固体平板上，放至 37 的恒温培养箱中培养 24 h。挑取平板上大小形态不同的单菌落分别划线至含60 mg/LTC/OTC/DC的LB固体平板上进行进一步纯化。而后，挑取纯化后的单菌落分别接种至含60 mg/LTC/OTC/DC的LB试管中，培养至对数期。将对数期菌液与50%甘油混合均匀（甘油终浓度为25%），保藏至-20 冰箱，以便后