松果菊苷通过调节AKR1B...癌MCF-7细胞的恶性进程_王倩婷.pdf

年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 浙江省中医药科学研究基金项目（）通信作者王倩婷，中药师，主要从事中药药理学研究，：松果菊苷通过调节 信号传导抑制乳腺癌 细胞的恶性进程王倩婷，江砚，徐良辉，陈佳丽（浙江大学 医学院 附属杭州市第一人民医院 中药房，浙江 杭州）摘要 分析松果菊苷（）调控醛酮还原酶（）细胞外调节蛋白激酶（）通路对乳腺癌（，）细胞增殖、转移以及阿霉素（，）耐药的作用。首先确定松果菊苷的化学结构，不同质量浓度（、）松果菊苷对 细胞进行 干预，应用免疫印迹（）法分析 通路相关蛋白的表达；细胞计数试剂盒（）分析细胞活性。收集 细胞并分为对照组（）、松果菊苷组（）、松果菊苷过表达对照组（）以及松果菊苷 过表达组（），分析 通路相关蛋白的表达；和 法分析细胞活性；划痕、实验、评估细胞转移。最后利用 对 细胞进行 干预，构建 耐药细胞，检测细胞活性；原位末端标记法（）和 评估细胞凋亡。蛋白质资料库（）数据库和分子对接预测了松果菊苷和 两者的结合关系。与对照组相较，不同浓度松果菊苷可剂量依赖性削减 细胞中 通路相关蛋白水平，细胞活性也表现出显著的下降趋势。与 比较，暴露于 松果菊苷下的 细胞中 通路、细胞增殖、转移和 耐药性被抑制；与 相较，在松果菊苷处理后的 细胞中过表达 会导致 细胞以上生物学行为部分恢复。松果菊苷与 具有靶向关系。松果菊苷可阻碍乳腺癌细胞增殖、转移和 耐药，其机制可能与阻断 通路有关。关键词 松果菊苷；信号；乳腺癌；阿霉素耐药 ，（，）（），（）（）（）（）（，）（），（），王倩婷等：松果菊苷通过调节 信号传导抑制乳腺癌 细胞的恶性进程 （）（），；：.迄今为止，乳腺癌（，）是当前最常见的女性恶性肿瘤，诊断中位年龄为 岁左右。中国 新发病率占全球的.，死亡比例占全球的.。遗传因素和环境因素如高脂肪饮食、酒精摄入以及运动不足都属于诱发乳腺癌的危险因素。现代治疗手段仍涵盖手术治疗、放射治疗和药物治疗。常见的临床药物包括环磷酰胺、氟尿嘧啶、吡柔比星、枸椽酸他莫昔芬等，而 细胞中抗药性的存在也在一定程度上给 的治疗带来了巨大挑战。同时作为一种异质性肿瘤，更易向发生骨、肺、肝和脑等器官发生转移，从而导致转移性乳腺癌在很大程度上无法治愈。肉苁蓉是我国的传统药材，属列当科植物，素有“沙漠人参”之称。松果菊苷（，）是一种提取自肉苁蓉的苯乙醇苷，近年研究已经着重强调了松果菊苷具有很强的抗氧化、抗炎和抗癌性。如通过抑制 通路，可以缓解扑热息痛诱导的肝脏损伤中的炎症反应和氧化应激。多项证据证实，主要在 中发挥抑癌作用，其机制可能与通过下调 和 表达或是阻断 信号传导有关。醛酮还原酶超家族成员醛酮还原酶（）可通过氧化还原反应将有毒物质转化为无毒物质，并产生相应的醇类物质，从而发挥对宿主细胞的保护作用。研究提示，主要在结肠和小肠等正常人体组织中表达。更有研究揭露，在乳腺癌中主要充当致癌基因，并可能成为乳腺癌潜在的生物标志物。作为 家族中的关键成员，细胞外调节蛋白激酶（）控制后生动物各类进化保守的细胞进程，失调可导致各类疾病的发生。等揭示 可通过激活 信号从而促进乳腺癌的进展。更有趣的是，网站预测到 是松果菊苷的一个潜在靶点。然而，是否通过介导 信号从而参与乳腺癌进展还未可知。本次研究重点探讨 对 恶性细胞表型的具体影响并阐明 与 通路两者在 细胞中的相互关系。材料人正常乳腺上皮细胞株 以及人乳腺癌细胞系 均由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供；耐药细胞购自上海沪震实业有限公司。培养基（批号）、马血清（批号）和胎牛血清（批号）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；（批号）购自美国 公司；（批号）购自江苏凯基生物技术股份有限公司；裂解液（批号）购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白定量试剂盒（批号）购自康为世纪生物科技有限公司；试剂（批号）购自上海碧云天生物技术股份有限公司；转染试剂（批号）购自赛默飞生物科技有限公司。和 质粒由重庆优宝生物技术有限公司提供；试剂（批号）和 试剂盒（批号）购自广州锐博生物科技有限公司；（批号）购自上海翌圣生物科技有限公司；基质胶（批号）和 小室（批号）购自美国 公司；多聚甲醛（批号）、结晶紫（批号）和 溶液（批号）由美国 公司提供；兔源（批号）、磷酸化（，批 号）、（批 号）、钙黏素（，批号）、钙黏素（，批号）、（批号 年 月第 卷第 期.，.，）、淋 巴 细 胞 瘤（，批号）、相关 蛋白（，批号）抗体和 标记的羊抗兔二抗（批号）均购自美国 公司；发光试剂盒（批号）购自北京酷来搏科技有限公司。软件购自美国 公司；荧光显微镜和 倒置显微镜购自德国徕卡显微系统；.软件购自美国 公司。方法.细胞培养与处理 细胞于含有 马血清、表皮生长因子、.皮质醇、胰岛素、霍乱毒素的 培养基中进行培养；和 细胞于含有 的 培养基中进行培养。所有培养基均添加 双抗并保存于 含 的湿润气氛中。随之应用不同质量浓度（、）对 细胞进行 干预；并应用.从而维持 细胞耐药性。.免疫印迹（）法 细胞中的蛋白通过 裂解液进行提取，蛋白浓度由 试剂测定。利用 膜转移经 分离的蛋白；经 脱脂牛奶室温封闭 后，膜与（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）一抗 条件下孵育过夜，随之加入 标记的羊抗兔二抗（）室温孵育 。加入 发光试剂盒检测目的蛋白，并利用 软件对蛋白丰度进行分析。.法检测细胞活性 将 和 细胞种植于 孔板中进行培养（个孔），后应用不同质量浓度（、）进行干预，后，给予 体积分数的 试剂处理，后对细胞活性进行检测。为了深入探究 对 细胞活力的影响，转染或未经转染的 细胞培养 后，应用不同质量浓度（、）进行干预，分别于、时加入 体积分数的 试剂，细胞活性检测方法与上述一致。为了探究 对 细胞阿霉素耐药性的影响，将 耐药细胞与 共培养，随后加入 工作液并检测细胞活性。.质粒转染 细胞于 孔板中（个 孔）接种培养，当细胞达到 融合度时，严格按照 转染试剂说明将 和 瞬时转染至各组细胞中，后转染完成。.染色检测细胞增殖 细胞经 处理和质粒转染后，每孔加入 下孵育 。随后，细胞分别经 多聚甲醛和.进行固定和透化处理。最后于荧光显微镜下检测 染色后的 阳性细胞。.划痕（）实验检测细胞迁移在 孔板中加入处于生长对数期的 细胞，细胞达到 融合度时，使用 无菌枪头划 条线，洗涤 次。在倒置显微镜下测量、的伤口宽度，测定转移细胞数目。.实验检测细胞侵袭 将 处理和质粒转染后的 细胞接种于含有基质胶的 上室内，下室加入 含 的 培养基。后，表层细胞被棉签擦去，细胞经多聚甲醛和结晶紫分别固定和染色，于显微镜下对侵袭细胞进行计数。.染色检测细胞凋亡经 干预后，将 处理和质粒转染后的 耐药细胞接种于 孔板中，经 多聚甲醛和.进行固定和透化处理后添加 检测液，在试剂盒说明书指导下 反应，进行 细胞核染色。荧光显微镜下随机选取 个视野观察细胞凋亡情况。.分子对接 蛋白的三维结构（：）通过 数据库（：）获取。运用 .软件对有效成分进行除水、去除不相关的原配体，随后通过.软件（：）将 化学结构转化为 格式，最后利用 .进行分子对接，选择其中自由能最低（.）的 进行可视化。.统计分析 本研究采用 .软件对实验数据进行分析处理，并表示为均数标准差（?）。组间比较采用单因素方差分析。.表示王倩婷等：松果菊苷通过调节 信号传导抑制乳腺癌 细胞的恶性进程差异具有统计学意义。结果.抑制 细胞中 信号传导 首先，结果揭示，随着 暴露剂量的增加，细胞中 和 蛋白水平降低，且下降趋势呈剂量依赖性（.）（图）。由此可猜测 可能通过调控 信号从而参与 恶性进展。对照组；松果菊苷处理 细胞组（图 同）。与对照组相比.，.，.（图 同）。图 松果菊苷对 细胞中 信号传导的影响（?，）.（?，）.过表达 逆转了 对 细胞增殖的抑制作用 实验数据表明，与 正常细胞相较，不同质量浓度的（、）暴露导致 癌细胞活性呈浓度依赖性减弱，且当 质量浓度为 时，细胞活性下降的最为显著，因此应用 进行后续实验。为了进一步验证 是否通过调控 信号从而调控 发展，首先利用 质粒对 细胞进行转染。转染 后，表达水平显著升高。蛋白印迹结果显示，质粒转染诱导 暴露所致削减的 和 蛋白水平再次增加。此外，和 实验数据证明，处理对 细胞增殖的抑制作用可被 上调所缓解（图）。由此可见，过表达 可拯救 对 细胞增殖能力的抑制作用。.过表达 逆转了 对 细胞转移的抑制作用同样，与对照组相较，给药导致细胞迁移和侵袭数目明显下降；而与 组相较，表达增加可导致细胞迁移和侵袭能力增强。另外，与对照组相比，处理后 和 蛋白水平明显下降，而 水平明显增加；而与 组相比，上调后 和 蛋白水平升高，而 水平下降（图）。总之，表达上调可逆转 给药对 细胞迁移、侵袭能力的抑制作用。.过表达 逆转了 对 细胞 耐药的抑制作用 细胞经 干预 后，检测发现，耐药细胞较 大幅度上升。与此同时，在 细胞中，暴露导致耐药细胞 急剧下降；在该环境下过表达 可有效提升。为了进一 步 确 定 细 胞 的 耐 药 性，利 用 实验和 检测细胞凋亡情况。经 干预 后，凋亡细胞数目急速增长，同时进行 给药后，细胞凋亡能力再次上升；而与 组相较，组中细胞凋亡有所缓解。此外，单独或 及 联合处理所导致的 蛋白水平下调和 蛋白水平上调因 质粒转染而分别逆转。通过分子对接技术，与 的靶向关系得到了充分验证（图）。综上所述，上调抵消了 对 细胞 耐药的抑制作用。讨论肿瘤转移是肿瘤最具有威胁性的一个特点，也是肿瘤久治不愈的根本原因。化疗是乳腺癌临床治疗的常用手段。随着乳腺癌治疗手段与理念的不断进步和更新，乳腺癌的预后已然得到了显著改善。然而耐药性的出现极大程度上限制了 年 月第 卷第 期.，.，细胞转染空白质粒组；细胞转染 过表达质粒组；细胞转染空白质粒 处理组；转染过表达 质粒 处理组；与 组比较.，.（图 同）。图 松果菊苷对调控 表达对 细胞增殖的作用（荧光染色，；?，）.（，；?，）药物的临床有效性。有研究发现，约 的转移性乳腺癌患者和 的晚期乳腺癌患者会对药物治疗产生耐药性。是一种蒽环类抗生素，通过作用于 化学结构而广泛应用于转移性或复发性乳腺癌的临床治疗，可有效降低乳腺癌患者的复发率和病死率。因此，本研究重点探讨 细胞的增殖、转移及 耐药性，从而深入揭露 进展的调控机制，并寻找潜在的干预分子靶标。松果菊苷是一种源自天然草本植物肉苁蓉和紫锥菊根茎的苯乙醇苷化合物，具有抗氧化、抗抑郁、王倩婷等：松果菊苷通过调节 信号传导抑制乳腺癌 细胞的恶性进程图 松果菊苷调控 表达对 细胞转移的作用（；?，）.（；?，）抗炎、抗病毒、抗肿瘤以及抗菌等多种药理 功效。近年研究报道称 可通过调控 通路从而遏制卵巢癌细胞增殖、转移和血管生成；可通过激活 通路从而在肝癌中发挥其抗癌活性。可通过使 信号通路失活从而妨碍 肿瘤生长。本研究中首先通过 预测到 是 的一个潜在靶点。因此作者猜测 可通过调控 相关的信号通路从而参与 疾病进展。截止目前已发现 在多种癌症中表达增加，并发挥促癌作用。此外，可通过激活 信号从而加剧膀胱癌、肺腺 癌、发 展 进 程，。乳 腺 癌 细 胞 中 异位表达促进 磷酸化从而激活 信号通路。信号通路通过激活，尤其是，促进细胞外基质降解，从而促进肿瘤细胞侵袭和肿瘤转移。本次实验结果同样表明，经不同浓度 处理后，通路相关蛋白表达呈现剂量依赖式下降，表明 可能通过抑制 通路参与 调控机制。此外，暴露也导致 细胞活性出现不同程度的削减。为了进一步证明此观点，本研究将 过表达质粒转染至 细胞中，发现 处理对 通路和细胞增殖、迁移和侵袭、上皮间质转化的抑制作用被 过表达所挽救。此外，在 耐药细胞中，暴露导致 降低，凋亡细胞数目增加；而在该环境下过表达 可再次提高 并减少凋亡细胞产生。实验最后 与 的靶向关系也得以充分验证。以上实验结果表明，过表达可实现对 抑制 发展的拮抗作用。综上所述，给药可减弱 细胞的增殖、迁 年 月第 卷第 期.，.，处理 细 胞 组；和