烟草悬浮细胞在镉胁迫下微丝形态与黏弹性变化的实时监测_刘艺璇.pdf

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 17 卷 第 6 期 2022 年 12 月Vol.17,No.6 Dec.2022 基金项目:国家自然科学基金面上项目(31670955);湖南省教育厅科学研究项目(20A246)第一作者:刘艺璇(1994),女,硕士研究生,研究方向为植物细胞力学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20210827001刘艺璇,周铁安,兰雅琴,等.烟草悬浮细胞在镉胁迫下微丝形态与黏弹性变化的实时监测J.生态毒理学报,2022,17(6):277-286Liu Y X,Zhou T A,Lan Y Q,et al.Real-time monitoring of microfilament morphology and viscoelasticity of tobacco suspension cells under cadmiumstress J.Asian Journal of Ecotoxicology,2022,17(6):277-286(in Chinese)烟草悬浮细胞在镉胁迫下微丝形态与黏弹性变化的实时监测刘艺璇1,周铁安1,2,兰雅琴1,潘炜松1,2,*1.湖南农业大学生物科学技术学院,长沙 4101282.湖南省细胞力学与功能分析工程技术研究中心,湖南农业大学,长沙 410128收稿日期:2021-08-27 录用日期:2021-11-29摘要:本文利用增强型绿色荧光蛋白标记微丝(Lifeact-EGFP)的烟草为供试材料,在 LumascopeTM720 全自动活细胞成像系统下观察了 10-410-8mol L-1镉离子胁迫下及空白对照的 Lifeact-EGFP 烟草悬浮细胞的微丝聚合-解聚情况的实时变化。使用石英晶体微天平技术监测了 10-4 10-8mol L-1镉离子胁迫下及空白对照的烟草悬浮细胞黏弹性实时变化。进而测定了10-410-8mol L-1镉离子胁迫下及空白对照的烟草悬浮细胞的过氧化氢酶活力变化情况。研究发现,在镉逆境胁迫早期,烟草悬浮细胞的微丝结构、细胞黏弹性指数变化和逆境相关酶活力变化存在一定程度的关联。本研究尝试从细胞层面探索镉毒害对烟草细胞生理特征的影响,为镉胁迫下植物细胞生理生化研究提供了新证据。关键词:镉胁迫;烟草悬浮细胞;细胞骨架;微丝;细胞黏弹性;CAT;动态监测文章编号:1673-5897(2022)6-277-10 中图分类号:X171.5 文献标识码:AReal-time Monitoring of Microfilament Morphology and Viscoelasticity ofTobacco Suspension Cells under Cadmium StressLiu Yixuan1,Zhou Tiean1,2,Lan Yaqin1,Pan Weisong1,2,*1.College of Biological Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China2.Hunan Provincial Engineering Technology Research Center for Cell Mechanics and Functional Analysis,Changsha 410128,ChinaReceived 27 August 2021 accepted 29 November 2021Abstract:In this paper,using tobacco with enhanced green fluorescent protein labeled microfilament(Lifeact-EG-FP)as the test material,real-time changes in the polymerization and de-polymerization of microfilaments of Life-act-EGFP tobacco suspension cells in the presence and absence of cadmium stress(10-410-8mol L-1)were ob-served under the LumascopeTM720 automatic live cell imaging system.Quartz crystal microbalance(QCM)tech-nology was used to monitor the real-time changes of viscoelasticity of tobacco suspension cells under the stress of10-410-8mol L-1cadmium ion and in the absence of cadmium ion.Moreover,the changes in catalase activity oftobacco suspension cells under the stress of 10-4to 10-8mol L-1cadmium ion and the blank control without cad-mium ion were measured.It was found that changes in the microfilament structure,cell viscoelasticity index and278 生态毒理学报第 17 卷cadmium stress related enzyme activity of tobacco suspension cells were correlated to some extent in the early stageof cadmium stress.This study attempts to explore the effects of cadmium toxicity on the physiological characteris-tics of tobacco cells from the cellular level,and provides new evidence for the physiological and biochemical re-search of plant cells under cadmium stress.Keywords:cadmium stress;tobacco suspension cells;cytoskeleton;microfilament;cell viscoelastic index;CAT;dynamic monitoring 近年来随着我国工业化、城镇化的快速推进,以及大量化肥和农药的使用,加之污水灌溉、固体垃圾堆积及矿山开采冶炼等多种原因,导致重金属特别是镉污染日趋严重。镉(cadmium,Cd)是环境中常见的重金属元素,却并非植物生长发育所需的必需元素。相反,当镉累积到一定浓度时,植物的生长发育与生理活动会受到不同程度的影响。镉对植物毒害的表现形式多种多样1,游离镉毒害使植物细胞骨架组装紊乱2,超微结构表现异常3,叶绿体膜系统崩溃及类囊体结构退化4,组织完整性受损直至植株死亡5。水体中的镉污染可导致水生植物氮代谢紊乱、氮素积累量下降6;游离镉可推动水体中藻类群落演替7,使水体中浮游植物多样性下降8。环境中的镉还在水稻等植物中富集9,通过食物链进入人体,严重影响人类健康10。吸收入植物体内游离镉,易与酶活性中心或蛋白质中的巯基结合,取代原本位于活性中心的其他二价金属离子,使酶失去原有功能而失活变性,含有 Zn、Mg 和 Fe 的酶及光合磷酸化和呼吸电子传递链等生理活动都将受到抑制和破坏11。植物的镉逆境胁迫响应是多个代谢酶系统共同参与的整体调控反应12。镉胁迫影响植物内生激素平衡,光合能力受损13;镉胁迫烟草各项激素与膜质过氧化系统呈现低浓度下合成上升而高浓度时下降的特征14;过氧化酶系统对清除镉毒害产生的活性氧具有重要作用15;植株整体可借助自身结构将所吸收的镉钝化并转移,减少外环境中镉毒害影响16;小麦根系在镉胁迫下会改变氨基酸分泌物以减轻镉危害17。植物防御素类似物蛋白调控基因CAL1可指导重金属螯合物的合成,借此定向调控镉在植株体中的积累过程18。细胞自噬过程中可能通过调节活性氧应答镉胁迫19。植物的不同器官对镉耐受程度有所区别,镉在水稻不同部位累积为根茎叶鞘叶片20。镉胁迫可能通过影响微管蛋白组装而扰乱正常的染色体聚合与分配过程,并引发染色体畸变21。徐萍22发现在 10-5molL-1镉浓度下大蒜(Allium sativumL.)根尖分裂间期微管会出现异常条纹、断片和碎片化;分裂期微管会出现异常的微管凝结现象。目前对于植物吸收镉机理的生物学研究大多集中在模式植物和常见农作物,对植物悬浮细胞在重金属胁迫下力学参数变化的研究目前报道较少,我们对砷胁迫23和镉胁迫下植物悬浮细胞的整体黏弹性与应力变化进行了初步的探索。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 供试材料Lifeact-EGFP 烟草悬浮细胞:自行构建的增强型绿色荧光蛋白标记微丝24(Lifeact-EGFP)的转基因本氏烟草(Nicotiana benthamiana)(以下简称 Life-act-EGFP 烟草)。在含有 100 mg L-1潮霉素(上海生工)的 1/2 MS 培养基平板上播种 Lifeact-EGFP 烟草,待种子萌芽未出真叶时,将萌芽转移到 BY-2 培养基平板(MS+3.0 mg L-12,4-D+1.0 mg L-16-BA+30 g L-1Sucrose+15 gL-1Agar)上诱导愈伤组织,愈伤组织长出后再传代 3 4 次,挑取色泽淡黄、质地松散的愈伤组织转入 BY-2 细胞液体培养基(MS+3.0 mg L-12,4-D+1.0 mgL-16-BA+30 gL-1Su-crose)中扩增,每 2 周继代一次,继代时取少量细胞悬浮液镜检,直至得到离散程度较高的烟草悬浮细胞。1.2 实验方法1.2.1 镉胁迫下烟草细胞微丝组装程度变化实时监测 配制含镉 BY-2 液体培养基:将 CdCl2 2.5H2O晶体(国药化学试剂有限公司,分析纯)溶解于 BY-2液体培养基中,配制 10-2mol L-1培养基母液,梯度稀释至 10-8mol L-1。静电黏附界面修饰:与动物上皮细胞不同,植物悬浮细胞不具备贴壁效应,需要一个被修饰的界面使之形成基本同一的单层,以备后续观察及监测。聚二烯丙基二甲基氯化铵(poly dimethyl diallyl am-monium chloride,PDADMAC)是一种高分子强阳性第 6 期刘艺璇等:烟草悬浮细胞在镉胁迫下微丝形态与黏弹性变化的实时监测279 电解质,工业生产中常用于捕捉带负电的物质,此处用于植物细胞的静电黏附修饰25。ITO 小池为实验室自制,底部为氧化铟锡(indium tin oxide,ITO)镀层玻片(珠海凯为光电股份有限公司),小池最大容量1 000 L,实验中所用最大容量为 500 L。将 ITO小池置于超净台内,紫外线照射灭菌不少于30 min。向 ITO 小池中加入 200 L 经过滤灭菌的 1%(VV)PDADMAC(Sigma-Aldrich,德国)溶液,遮光修饰不少于 30 min,然后吸去多余的 1%PDADMAC 溶液,在超净工作台内以超纯氮气(长沙鑫湘气体分析仪器经营部)吹干,使 ITO 表面形成一层静电修饰膜。完成后以小块封板膜密封池口保持内部洁净无菌。在 ITO 玻底