小麦TaPAT1-2D基因的克隆与表达分析_董飞燕.pdf

浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2023，35(1):23 32http:/www zjnyxb cn董飞燕，宋婧含，张华东，等 小麦 TaPAT1-2D 基因的克隆与表达分析 J 浙江农业学报，2023，35(1):23 32DOI:10.3969/j issn 1004-1524.2023.01.03收稿日期:2022-04-06基金项目:湖北省自然科学基金(2021CFB393);湖北省中央引导地方科技发展专项(2020ZYYD011);国家小麦产业技术体系建设专项(CARS-03)作者简介:董飞燕(1997)，女，河南驻马店人，硕士研究生，研究方向为小麦育种栽培。E-mail:2064276160 qq com*通信作者，方正武，E-mail:fangzhengwu88163 com;刘易科，E-mail:hbliuyk foxmail com小麦 TaPAT1-2D 基因的克隆与表达分析董飞燕1，2，宋婧含1，3，张华东1，2，吴昊天2，李雅倩1，2，刘孟伟2，高春保1，2，方正武1，*，刘易科2，*(1 长江大学 农学院，农业农村部长江中游作物绿色高效生产重点实验室(部省共建)，湖北 荆州 434025;2 湖北省农业科学院 粮食作物研究所，粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室，农业农村部华中地区小麦病害生物学科学观测实验站，湖北 武汉 430064;3 浙江大学 农业与生物技术学院，浙江 杭州 310058)摘要:GRAS(GIBBERELLIN-INSENSITIVE，repressor of ga1-3 and SCARECROW)基因家族作为重要的植物转录因子在调控植物生长发育、抵抗逆境胁迫的各种信号转导途径中发挥重要作用。为进一步挖掘该家族小麦抗赤霉病相关基因，从禾谷镰刀菌诱导的小麦转录组测序数据筛选出差异表达基因 TaPAT1-2D(TraesCS2D02G198200.1)，克隆该基因的全长序列，并对其进行生物信息学和表达模式分析，以及亚细胞定位和酵母转录激活活性研究。生物信息学分析结果表明:TaPAT1-2D 序列全长 1 668 bp，编码 555 个氨基酸，分子量约为 61.34 ku;TaPAT1-2D 蛋白含有典型 GRAS 功能结构域，在进化关系上与水稻 OsCIGR2(LOC_Os07g39470.1)关系较近;TaPAT1-2D 启动子区包含茉莉酸甲酯、脱落酸、生长素等植物激素响应元件与光应答元件等。实时荧光定量 PCR 结果显示，接种禾谷镰刀菌孢子液 72 h 后，TaPAT1-2D 基因在 4 个不同赤霉病抗性小麦品种中的相对表达水平明显上调，表明该基因参与赤霉病的响应过程。农杆菌介导的烟草中瞬时表达试验结果表明，TaPAT1-2D 蛋白定位于细胞核和细胞膜中。酵母转录激活活性实验表明，TaPAT1-2D蛋白具有转录自激活能力。研究结果为深入研究 TaPAT1-2D 基因的功能奠定了基础。关键词:小麦;GRAS 转录因子;亚细胞定位;表达分析;自激活中图分类号:S512文献标志码:A文章编号:1004-1524(2023)01-0023-10Clonging and expression analysis of TaPAT1-2D gene in wheatDONG Feiyan1，2，SONG Jinghan1，3，ZHANG Huadong1，2，WU Haotian2，LI Yaqian1，2，LIU Mengwei2，GAO Chun-bao1，2，FANG Zhengwu1，*，LIU Yike2，*(1 MARA Key Laboratory of Sustainable Crop Production in the Middle Reaches of the Yangtza River(Co-Construc-tion by Ministry and Province)，College of Agronomy，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China;2 HubeiProvincial Key Laboratory of Germplasm Innovation and Genetic Improvement of Food Crops，Wheat Disease BiologyResearch Station on Central China，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Food Crops Institute，Hubei Academy ofAgricultural Sciences，Wuhan 430064，China;3 College of Agriculture and Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China)Abstract:As a plant-specific transcription factor，the GRAS(GIBBERELLIN-INSENSITIVE，repressor of ga1-3and SCARECROW)gene family plays a vital role in plant growth and stress tolerance To further explore the geneinvolved in response to Fusarium head blight of wheat in this family，the research screened out the differentially ex-pressed gene TaPAT1-2D(TraesCS2D02G198200.1)from the Fusarium graminearum spore-induced wheat transcrip-tome sequencing data，and conducted its full-length cloning，bioinformatics analysis，expression pattern analysis，subcellular localization，and transcription activation studies The results of bioinformatics analysis showed that theexon sequence of TaPAT1-2D was 1 668 bp，encoded 555 amino acids，and had a molecular weight of around 61.34ku Its protein sequence comprised a typical GRAS functional domain and was phylogenetically related to rice OsCI-GR2(LOC_Os07g39470.1)In the promoter region，TaPAT1-2D contained some plant hormone response elementsand light-responsive elements including methyl jasmonate response elements，auxin response elements，abscisic acidresponse elements，Etc Quantitative real-time PCR results revealed that expression level of TaPAT1-2D gene wasup-regulated at 72 h after inoculating with F graminearum spore liquid in four distinct resistants，indicating that thisgene was involved in response to Fusarium head blight Agrobacterium tumefaciens-mediated transient expression wascarried out in tobacco and the result showed that TaPAT1-2D protein was localized in the nucleus and cell membraneThe yeast transcription activation experiments verified that the protein could self-activate transcription This studylaid the foundation for studing TaPAT1-2D genes functionKey words:wheat;GRAS transcription factor;subcellular localization;expression analysis;self-activation作为世界上重要的粮食作物之一，小麦为全球五分之一的人口提供粮食，因此保证小麦稳产和高产具有重要意义。小麦在生长发育过程中会面临各种逆境因素，近年来由于全球温度升高和小麦耕作制度的改变，小麦赤霉病发生频率逐渐增加1。小麦赤霉病又称烂穗病，是由多种镰刀菌侵染所引起的一种世界性病害，导致苗腐、茎基腐、秆腐和穗腐，其中，穗腐危害最为严重，湿度大时，发病部位可见粉红色霉层。小麦赤霉病影响小麦产量和质量，而且感病小麦中镰刀菌合成的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON，又称致吐毒素)会严重影响食品安全，危及人畜健康2。提高小麦品种抗病性是赤霉病防控最为经济、环保且有效的手段，而挖掘小麦抗赤霉病基因，对抗病品种培育至关重要。GRAS 蛋白作为植物重要的转录因子，在多种信号转导途径中发挥重要作用。早期在拟南芥中根据结构差异将 GRAS 蛋白家族分为 8 个亚家族，即 DELLA、SCR、LS、PAT1、HAM、SCL3、SHR 和 LISCL 亚家族3。不同亚族在植物生长发育过程中发挥着不同功能，包括参与调控分生组织 的 形 成4、根 发 育5 8、赤 霉 素 信 号 转导9 10、光信号转导11 12、逆境胁迫应答13 等过程。但是目前针对参与生物胁迫的报道相对较少，主要聚焦在对病原菌的响应。Chen 等14 发现，被大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaicvirus)侵染后，小麦 TaSCL14 基因沉默植株细胞内的丙二醛(MDA)含量高于野生型，且细胞损坏程度大，间接说明 TaSCL14 基因对增强植株抵抗生物胁迫能力具有重要作用。Mayrose 等15 研究发现，在番茄受到丁香假单胞菌侵染时，番茄的 6个 SIGRAS 基因转录子表达水平上调，表明 SI-GRAS 基因可能参与由细菌触发的防御反应，响应生物胁迫。Day 等16 从水稻中发现了能被共培养的稻瘟病菌和 N-乙酰基壳寡糖激发子诱导的两个 AtPAT1 亚家族成员 OsCIGR1 和 OsCI-GR2，其可能在防御病原真菌信号的早期阶段中发挥转录调控的关键作用。林源17 通过稻瘟病抗性实验发现，同属 PAT1 分支的小佛肚竹 BvCI-GR 基因能在一定程度上增强植株对稻瘟病的抵抗能力。由此推测，GRAS 基因家族在小麦响应生物胁迫过程中发挥重要作用。分析小麦 GRAS 基因家族的转录组数据发现，禾谷镰刀菌侵染中国春小麦花序 4 d 后，PAT1 分支的 TaPAT1-2D 基因与对照相比表达量显著上调，说明 TaPAT1-2D 基因具有受禾谷镰刀菌诱