小尾寒羊与双乾肉羊的瘤胃菌群差异分析_彭洪洋.pdf

小尾寒羊与双乾肉羊的瘤胃菌群差异分析彭洪洋1，李玉梅1*，赵中利2，张英1，白春艳1，闫守庆1，马惠海2*（1.吉林大学动物科学学院,长春 130062；2.吉林省农业科学院畜牧兽医研究所,吉林 公主岭 136100）摘要：本试验旨在研究小尾寒羊(STH)及双乾肉羊(SQ)瘤胃微生物区系特征及品种间差异。随机挑选出生日期相近、初体重相近、健康的小尾寒羊和双乾肉羊各 6 只，采用 16S rDNA 扩增子测序方法，探究两个绵羊品种之间瘤胃微生物的差异，预测其微生物功能。结果表明，SQ 组瘤胃菌群多样性和丰富性均高于 STH 组；主坐标分析和非加权组平均法聚类分析显示组间具有差异性。两个品种绵羊瘤胃菌群在门水平上组成相似，优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门及变形菌门。对差异菌群进行 KEGG 功能预测，结果显示，双乾肉羊瘤胃微生物功能大部分高于小尾寒羊。从上述分析来看，双乾肉羊瘤胃菌群种类及丰度均高于小尾寒羊，这可能导致了双乾肉羊饲料利用率更高。关键词：小尾寒羊；瘤胃微生物；16S rDNA；菌群结构中图分类号：S826文献标识码：A文章编号：2096-5877（2023）01-0050-04Analysis on the Difference of Ruminal Microflora between Small-Tail HanSheep and Shuangqian Mutton SheepPENG Hongyang1,LI Yumei1*,ZHAO Zhongli2,ZHANG Ying1,BAI Chunyan1,YAN Shouqing1,MA Huihai2*（1.College of Animal Science,Jilin University,Changchun 130062;2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary,Jilin Academy of Agricultural Sciences,Gongzhuling 136100,China)Abstract：The purpose of this experiment is to investigate the ruminal microflora characteristics and differences between Small-tail Han sheep(STH)and Shuangqian mutton sheep(SQ).6 STH and 6 SQ were randomly selected,which were similar birth date,initial body weight and good health.The 16S rDNA amplicon sequencing method wasapplied to explore the microbial differences between the rumen of two breeds and predict the microbial function.The results indicated that the bacterial diversity and richness of rumen of Shuangqian mutton sheep are higher thanthose of Small-tail Han sheep.The principal coordinate analysis(PCoA)and UPGMA cluster analysis showed thatthe bacteria community in two groups was different.The composition of rumen microflora of the two breeds of sheepis similar at the phylum level and dominant phyla were Bacteroidetes,Firmicutes and Proteobacteria.The results ofKEGG pathway analysis revealed that the rumen microbial function of SQ was mostly higher than that of STH.Basedon the above analysis,the species and abundance of ruminal microflora of SQ were greater compared with STH,which could lead to higher feed utilization rate of SQ.Key words：Small-tail Han sheep;Rumen microbe;16S rDNA;Microflora composition瘤胃微生物对于反刍动物营养物质的消化起着重要作用，它们协助宿主将不易利用的饲料分收稿日期：2021-03-30基金项目：吉林省科技攻关项目（20190301006NY）；吉林省畜牧业管理局畜禽遗传资源多胎肉羊种群选育与开发项目（2021）；国家现代农业产业技术体系项目（CARS-38）作者简介：彭洪洋（1994-）,男,硕士，研究方向：动物营养与饲料科学。通讯作者：李玉梅，女，博士，副教授，E-mail:li_马惠海，男，博士，研究员，E-mail:解，为宿主供能。目前的研究已经表明，瘤胃内活跃的微生物除了细菌与真菌外，还有古细菌、病毒和原虫1。而细菌作为瘤胃内数量最巨大的一部分生物，参与纤维素的分解、淀粉和糖的发酵、蛋白质和维生素的合成。微生物与宿主的作用是相互的。一方面，宿主为微生物提供一个厌氧、温度适宜的环境2；另一方面，微生物降解纤维类物质，产生瘤胃可吸收利用的挥发性脂肪酸、菌体蛋白等，为宿主提供可利用物质基础3。诸多因素决定了微生物的结构组成和数量，目前广为接受的是饲粮影响了微生物的结构4，例如彭洪洋等：小尾寒羊与双乾肉羊的瘤胃菌群差异分析东北农业科学2023，48（1）：50-53，107Journal of Northeast Agricultural SciencesDOI:10.16423/ki.1003-8701.2023.01.0111期彭洪洋等：小尾寒羊与双乾肉羊的瘤胃菌群差异分析51饲粮的精粗比、饲粮的种类5等。影响瘤胃微生物的重要因素还有环境和管理策略6-7。此外，对于不同的宿主种类，微生物结构也表现出了差异性。小尾寒羊产肉品质优良，是具有高繁殖力的中国本地绵羊品种8。双乾肉羊是吉林省农业科学院利用杜泊羊为父本、吉林省本地绵羊为母本，通过杂交、回交以及横交固定等常规育种手段结合分子标记辅助选择方法，选育出的具有采食性好、生长速度快和产仔数高等种质特性的肉用羊新种群。众多研究结果表明，杜寒杂交羊无论日增重还是屠宰性能都优于小尾寒羊9。因此，当小尾寒羊及双乾肉羊在相同环境、饲喂相同饲料条件下，研究其体内微生物的组成与差异、预测微生物功能差异，为寻找与绵羊的生长速度、肉质等相关的微生物提供依据。1材料与方法1.1试验动物及试验设计本研究选用 12 只出生日期相近、健康无病、体重相似的雄性绵羊，其中小尾寒羊组(STH)、双乾肉羊组(SQ)各 6 只，在环境、饲粮与饲喂时间均相同条件下，分为两组进行饲养试验，试验于2019年3月至8月在吉林省农业科学院进行。1.2样品采集在饲养试验结束后，实验动物禁食 24 h，禁水2 h，屠宰后，剥离内脏，收集瘤胃液于 50 mL 已灭菌的离心管中，并立刻置于干冰中暂时保存，送回实验室保存于-80 冰箱，用于后续试验。1.3提取瘤胃微生物基因组DNA与构建基因文库使用 E.Z.N.A.StoolDNAKit，并按照说明书，对瘤胃细菌总 DNA 进行提取。使用细菌通用引物 341F(5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3)和 805R(5-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3)对 16S rRNA可变区 V3+V4 进行 PCR 扩增。使用 2%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物，并回收目标片段。纯化后的 PCR 产物在 Qbit 荧光定量系统上进行定量，文库浓度在 2 nmol/L 以上视为合格。将合格的文库使用 MiSeq 测序仪进行 2300 bp 的双端测序。本试验中建库及测序由杭州联川生物技术有限公司提供。1.416S rDNA基因文库分析原始读数数据在特定的过滤条件下进行质量过滤、嵌合序列过滤、解调，获得特征序列。经QIIME2 计算出 Alpha 多样性指数及 UniFrac 距离，并用于主坐标分析(PCoA)及非加权聚类树分析(UPGMA)。采用 Blast 进行序列比对，每个代表性序列用SILVA数据库列进行注释。1.5功能预测基于高质量序列，使用 PICRUSt 预测微生物基因组的功能。PICRUSt 通过 QIIME 软件将特征序列比对到数据库，将预测到的基因与 KEGG 数据库进行比对。2结果与分析2.1样品及特征序列数本研究在两组绵羊的瘤胃细菌的 V3+V4可变区经 16S rDNA 进行扩增、测序，获得 1 017 984 条原始 reads，去除低质量的序列后，产生 912 911 条高质量序列，平均每个样本有（76 0761 706）条，用于后续研究。对扩增子测序数据进行过滤、去重、过滤嵌合体等，共获得了 6 632 条特征序列，不考虑处理效应，平均每个样本有（55347）条。其中，SQ 组特有 1 552 条，STH 组特有 1 191 条。共享特征序列为 541 条，约占本次测序中全部特征序列的18.75%。2.2Alpha多样性为了探索两个绵羊品种瘤胃微生物群落组成，本研究初步评估了瘤胃微生物 Alpha 多样性。结果显示，SQ 组瘤胃微生物的 Alpha 多样性指数Chao1、Simpson 高于 STH 组，Chao1 与 Simpson 值越大代表物种总数越多，具体见表 1。并且 Shannon指数显著高于 STH 组(P0.05)，Shannon 指数值越大，群落多样性越高。覆盖率指样品文库覆盖度，该值越大，表示样品中没有被测到的概率越低。这表明，SQ 组瘤胃菌群多样性和丰富性均高于STH组，且样品文库覆盖度优良。表 1两组绵羊样品瘤胃细菌 Alpha 多样性指数项目香农指数辛普森指数丰富度指数覆盖率(%)注：P0.05 表示差异不显著SQ组6.860.710.970.02576.608599.820.04STH组6.430.190.960.07522.973899.820.02P值0.040.310.180.392.3Beta多样性UniFrac 距离度量用于评估样品中 Beta 多样性的变化，该变化与微生物群落组成的结构差异相对应。基于该距离，对样品进行了主坐标分析(PCoA)，结果如图 1 所示。由图 1 可知，无论是STH 组，还是 SQ 组，多数组内样本都汇聚在一起，52东 北 农 业 科 学48卷说明组内瘤胃微生物差异较小。图中两组样品聚为两类，表明两个组的微生物区系存在明显的差异，且UPGMA树结果进一步说明了两组绵羊瘤胃微生物的差异性。2.4不同水平菌群结构与组成本 次 测 序 统 计 了 各 分 类 水 平 上 相 对 丰 度top30 的菌落。在 SQ 组瘤胃微生物门水平上，拟杆菌门和厚壁菌门是最主要的菌门，它们各自占了该组总菌门的 47.44%和 31.09%，其次是变形菌门、放 线 菌 门 和 纤 维 杆 菌 门，分 别 占 14.79%、3.50%和 2.11%。在 STH 组中，拟杆菌门和厚壁菌门是优势菌门，其比例分别是 45.14%和 28.05%；变形菌门、纤维杆菌门和 SQ 组相比，丰度无显著差异(P0.05)。但 STH 组放线菌门(9.2