香蕉皮抗氧化和抑制人肝癌HepG2细胞活性研究_王士博.pdf

生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 1 期 140 145Current Biotechnology ISSN 2095-2341研究论文研究论文Articles香蕉皮抗氧化和抑制人肝癌HepG2细胞活性研究王士博，刘金娟*江苏师范大学生命科学学院，江苏 徐州 221116摘 要：对香蕉皮提取物（banana peel extraction，BPE）的体外抗氧化作用和抗肿瘤活性进行了研究。使用福林酚和硝酸铝法测定BPE中总多酚和总黄酮含量；通过检测DPPH和O2-自由基清除能力测定BPE的体外抗氧化活性；采用Alamar Blue法检测BPE对HepG2细胞活性的影响；荧光染色及流式技术检测HepG2细胞凋亡；免疫印迹技术检测凋亡蛋白的变化；Caspase活性检测试剂盒测定Caspase-3和Caspase-9的活性；Caspase-9和Caspase-3抑制剂验证BPE抗肿瘤相关的信号转导通路。结果表明，BPE中总多酚和总黄酮含量分别为39.23 2.35 mg L-1和26.53 1.97 mg L-1；BPE显示出一定的DPPH和O2-自由基清除能力（65.31%3.82%和51.29%4.23%），可明显抑制HepG2细胞的增殖（IC50=54.32 mL L-1）；BPE通过上调Caspase-3、Bax、Bid、Apaf-1、Bak、p53、Caspase-9的表达，下调Bcl-2、Bcl-xl的表达诱导HepG2细胞凋亡；Caspase-9和Caspase-3抑制剂（Z-LEHD-FMK、Ac-DEVD-CHO）在一定程度上逆转了BPE的增殖抑制活性。BPE具有一定的自由基清除能力，对HepG2细胞具有明显增殖抑制作用，这些结果为香蕉皮的进一步开发利用提供了数据支撑。关键词：香蕉皮提取物；抗氧化；HepG2细胞；凋亡DOI：10.19586/j.20952341.2022.0154 中图分类号：TS209 文献标志码：AStudy on Antioxidant Activity and Inhibitory Effect of Banana Peel on HepG2 CellsWANG Shibo，LIU Jinjuan*School of Life Science，Jiangsu Normal University，Jiangsu Xuzhou 221116，ChinaAbstract：The in vitro antioxidant and anticancer potential of banana peel extraction（BPE）against HepG2 cells was evaluated.Quantitative analysis for total phenolic and flavonoid content in BPE were determined by Folin-Ciocalteu and Al（NO3）3 colorimetric assay.The antioxidant activity of BPE in vitro was evaluated by measuring the scavenging capacity DPPH and O2-free radical.The anticancer effect of the BPE on HepG2 cells was investigated using Alamar Blue assay.The apoptosis of HepG2 cells was detected by fluorescence staining and flow cytometry.Western blot analysis was used to detect the changes of apoptotic proteins.Caspase activity kits were used to determine the activities of Caspase-3 and Caspase-9.The Caspase-9 and Caspase-3 specific inhibitors further validated the signal transduction pathway related to BPE anti-tumor.The total phenolic and flavonoid content in the BPE was 39.232.35 mg L-1 and 26.531.97 mg L-1，respectively.The BPE also demonstrated potent DPPH，O2-radical scavenging capacity（65.31%3.82%and 51.29%4.23%）.BPE significantly inhibited the proliferation of HepG2 cells with an IC50 value of 54.32 mL L-1.BPE induced HepG2 apoptosis by up regulating the expression of Caspase-3，Bax，Bid，Apaf-1，Bak，p53 and Caspase-9，and down regulating the Bcl-2 and Bcl-xl.Furthermore，Caspase-9 and Caspase-3 specific inhibitor（Z-LEHD-FMK and Ac-DEVD-CHO）reverse the proliferation inhibitory activity of BPE in HepG2 cells.BPE has a certain free radical scavenging capacity，and has an obvious inhibitory effect on HepG2 cell proliferation，providing data support for further development and utilization of banana peel.Key words：banana peel extraction；antioxidant；HepG2 cells；apoptosis收稿日期：20220831；接受日期：20221216基金项目：国家自然科学基金项目（81603150）；江苏师范大学研究生科研与实践创新计划项目（2022XKT0895）。联系方式：王士博 E-mail:；*通信作者 刘金娟 E-mail:王士博，等：香蕉皮抗氧化和抑制人肝癌HepG2细胞活性研究香蕉（Musa sapientum）是热带地区重要的经济作物，内部果肉为主要的食用部位。2020年，世界香蕉总产量为119.83109 kg，我国香蕉总产量为11.87109 kg，并且呈逐年上升趋势，我国已成为世界第二大香蕉生产国1。香蕉皮大约占果实重量的30%左右，大量香蕉皮的废弃不仅造成资源浪费，还会引起环境污染。研究表明，香蕉皮中含有丰富的淀粉、粗蛋白、粗脂肪和糖类、维生素、多酚类等物质2，具有抗高血压、抗癌、抗菌、抗氧化等活性3-4。香蕉皮中总黄酮对羟自由基、ABTS+自由基均有一定的清除能力及Fe3+还原能力5。Rebello等6发现香蕉皮粉因其总酚含量高而具有高抗氧化性。Akamine等7发现香蕉皮甲醇提取物对睾酮治疗小鼠前列腺增生有抑制作用。Fu等8从香蕉皮提取物中分离得到的新化合物 XJP-1 能抑制 ox-LDL 诱导的单核细胞内皮粘附。熊燕飞等9发现香蕉皮粗多糖可明显抑制体内实体瘤生长，体外对Hela细胞和前列腺癌PC-3M 细胞有明显的诱导凋亡作用，且随时间的延长，凋亡率增加。目前，国内对于香蕉皮的研究主要集中于多糖、多酚等物质的提取方法和工艺，对其功能及深加工方面的研究相对不足。关于香蕉皮提取物在抗癌和抗氧化活性方面的研究少有系统报道。充分发挥香蕉皮的资源优势，对其进行高值化开发利用，不仅可以减少对环境的污染，同时也能产生极大的经济价值和社会效益。因此，本文初步测定了香蕉皮提取物（banana peel extraction，BPE）中总黄酮和总多酚的含量，探究了BPE 对 DPPH 和 O2-自由基的清除能力以及对HepG2细胞增殖的抑制作用，以期为进一步综合利用香蕉皮提供数据支撑。1材料与方法1.1实验材料和试剂香蕉购自本地大型超市，正常成熟度，表面洗净晾干水分，取皮后用家用榨汁机取汁，12 000 r min-1，4 离心取上清，过滤除菌后-80 储存备用。Alamar Blue购自美国Sigma公司；Caspase-9、Caspase-3抗体购自美国Santa cruz公司；Bad、Bid、Bak、Apaf-1、Bax、Bcl-X、Bcl-2、p53和GAPDH抗体购自美国Bioworld公司；细胞裂解液、Caspase-9和Caspase-3活性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；PARP抗体和Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO购自碧云天生物技术研究所；Caspase-9抑制剂Z-LEHD-FMK购自Biovision公司；其余试剂均为国产分析纯。1.2供试细胞株人肝癌细胞HepG2购于上海中科院细胞库，由本实验室复苏、传代、培养。1.3仪器与设备IBE2000显微镜购自 COIC 公司；CO2细胞培养箱购自 Thermo 公司；微孔板检测仪购自 BioTeck公司；96孔细胞培养板购自美国NEST公司；荧光显微镜购自德国Leica公司。1.4方法1.4.1总多酚和总黄酮含量的测定采用福林酚法和硝酸铝比色法分别检测总酚和黄酮含量10。提取物中总酚和总黄酮的含量以每升 BEP 中没食子酸和芦丁当量表示。制作没食子酸（0200 g mL-1）标准曲线，按公式（1）计算BPE中总酚的含量：y=0.002 8x+0.003 5(R2=0.998 9)（1）其中y为吸收值；x为没食子酸浓度。制作芦丁（064 g mL-1）标准曲线，按公式（2）计算BPE中总黄酮的含量：y=0.011 6x+0.015 1(R2=0.997 5)（2）其中y为吸收值；x为芦丁的浓度。1.4.2DPPH自由基清除测定参照钟丘实等11测定方法，本研究使用的BPE为原液。1.4.3超氧阴离子自由基清除测定采用邻苯三酚自氧化法，参照佀凤为等12的方法，使用 BPE原液进行测定。1.4.4细胞培养与体外抗肿瘤活性实验采用Alamar Blue法检测BPE体外抗肿瘤活性，具体实验方法参照Liu等13的方法。1.4.5Hoechst 33258 染色取形态均匀状态良好的HepG2细胞接种于6孔培养板中，加入BPE培养 48 h 后，用倒置相差显微镜观察形态并拍照；细胞收集后，加入Hoechst33258染液（终浓度5 g mL-1），染色 10 min，荧光显微镜下拍照，实验重复3次。1.4.6流式细胞术检测细胞凋亡实验步骤参照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书。141生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology1.4.7活性氧检测按照试剂盒的说明书进行操作，10 mol L-1 DCFH-DA染液37孵育20 min。激发波长488 nm，发射波长525 nm，荧光显微镜观察。1.4.8Western blot 实验BPE 处理 HepG2 细胞48 h 后提取蛋白，SDS-PAGE 电泳分离，转移到PVDF膜上，封闭后加入一抗过夜，二抗37 孵育2 h，化学发光显色拍照。1.4.9Caspase酶活性的检测按照酶活性检测试剂盒说明书进行Caspase酶活性测定。1.4.10抑制剂对BPE抗肿瘤活性的影响HepG2细胞接种 96孔